【摘要】：Cripto-1是EGF-CFC家族的成員,在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。但目前為止,有關(guān)Cripto-1對(duì)免疫功能的影響尚不清楚。本文擬從巨噬細(xì)胞角度探討原癌基因Cripto-1對(duì)免疫功能的影響及其機(jī)制。為了探討Cripto-1對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響,我們建立了一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)Cripto-1的L02細(xì)胞系,并用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的上清液對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理,之后通過實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法檢測巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的情況。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組的巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6以及抗炎癥因子IL-10的表達(dá)顯著上調(diào),而抗炎癥因子TGF-β的表達(dá)并沒有發(fā)生明顯的變化。因?yàn)榉�(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞上清中除了含有Cripto-1蛋白外,還含有其它分泌蛋白,為了確定細(xì)胞上清對(duì)巨噬細(xì)胞分泌功能的影響是否是由Cripto-1引起的,我們用原核表達(dá)純化的Cripto-1蛋白處理巨噬細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ctipto-1蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響與細(xì)胞上清具有相同的趨勢。這些結(jié)果表明,Cripto-1可能通過上調(diào)巨噬細(xì)胞中某些炎癥因子和抗炎癥因子的表達(dá),進(jìn)而對(duì)機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生影響。之后我們研究了Cripto-1對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。我們選取小鼠原代巨噬細(xì)胞以及人的巨噬細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),利用穩(wěn)轉(zhuǎn)Cripto-1的細(xì)胞上清液或者純化的Cripto-1蛋白處理巨噬細(xì)胞,之后通過雞紅細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)檢測巨噬細(xì)胞的吞噬功能。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組的巨噬細(xì)胞吞噬能力較對(duì)照組有明顯提高。以上結(jié)果表明,Cripto-1對(duì)巨噬細(xì)胞的分泌功能和吞噬功能均具有一定的調(diào)節(jié)作用。我們進(jìn)一步分析了Cripto-1調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。我們利用純化的Cripto-1蛋白處理巨噬細(xì)胞,20分鐘后檢測NF-κB信號(hào)的活化情況。結(jié)果顯示,Cripto-1處理后,巨噬細(xì)胞中的p-IKK水平顯著提高,并且p65的入核也顯著增加。也就是說,Cripto-1激活了巨噬細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路。為了闡明Cripto-1是否是通過NF-κB信號(hào)通路來調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的,我們又利用NF-κB信號(hào)通路的抑制劑PDTC去抑制細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號(hào),之后檢測巨噬細(xì)胞的功能。結(jié)果顯示,Cripto-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌功能和吞噬功能被明顯抑制。以上結(jié)果提示,Cripto-1可通過激活NF-κB信號(hào)途徑增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能,并促進(jìn)部分炎癥因子及抗炎癥因子的表達(dá)。Skp2(S-phase kinase associated protein 2)屬于F-box蛋白家族成員,在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn),293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Cripto-1的真核表達(dá)載體后,細(xì)胞中Skp2的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯被抑制。而且我們通過報(bào)告基因法和免疫印跡法證明在293T細(xì)胞中,Cripto-1的過表達(dá)明顯抑制了p38/MAPK信號(hào)通路。暗示Cripto-1調(diào)控Skp2的表達(dá)是通過p38/MAPK信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。那么為了證明這一結(jié)果,我們將p38的失活突變體DN-p38轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞內(nèi)以抑制p38/MAPK信號(hào)。結(jié)果顯示,當(dāng)p38/MAPK信號(hào)被抑制以后,Skp2的表達(dá)量明顯下降。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,Cripto-1可通過p38/MAPK信號(hào)通路調(diào)控Skp2的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上結(jié)論,我們利用靶向Cripto-1的siRNA對(duì)Huh7細(xì)胞進(jìn)行處理。結(jié)果顯示,當(dāng)Cripto-1表達(dá)下調(diào)時(shí),p38被激活,Skp2的表達(dá)上升。但是當(dāng)共轉(zhuǎn)染p38的失活突變體DN-p38后,這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果被逆轉(zhuǎn),即下調(diào)了p-p38的表達(dá),Skp2的表達(dá)量也隨之降低。以上研究結(jié)果提示,Cripto-1通過抑制p38/MAPK信號(hào)通路調(diào)控Skp2的表達(dá)。本研究證實(shí)了原癌基因Cripto-1參與了機(jī)體免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控,這為我們研究癌基因與機(jī)體免疫功能之間的關(guān)系奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。并且Cripto-1還可通過p38/MAPK信號(hào)通路調(diào)控原癌基因Skp2的表達(dá)。這一研究結(jié)果為人們開發(fā)以Skp2為靶點(diǎn)的抗癌藥物提供了重要的理論依據(jù)。
【圖文】：

二）原癌基因 Skp2 的結(jié)構(gòu)癌基因 Skp2 定位于常染色體 5p13，其基因全長大約為 31962b2 編碼的產(chǎn)物由 436 個(gè)氨基酸組成[115]。kp2 包括一個(gè) F-box 結(jié)構(gòu)域、十個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)域和 Lin中 Fox 結(jié)構(gòu)域的作用是可以與 Skp1 相結(jié)合，富含亮氨酸的重復(fù)物識(shí)別的區(qū)域[115]。三）原癌基因 Skp2 的生物學(xué)功能kp2 可以與 Skp1 和 Cull 共同組成 SCF 復(fù)合物，SCF 復(fù)合物又稱合物，，其作為一個(gè) E3 連接酶，在泛素-蛋白酶體降解途徑中發(fā)揮

Cripto-1 是表皮生長因子 EGF-CFC 家族成員，已經(jīng)證過程中發(fā)揮重要作用。本研究主要從巨噬細(xì)胞角度探功能的影響，以及 Cripto-1 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)制原癌基因 Cripto-1 對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響，我們首先構(gòu)L02 細(xì)胞系。我們將 Cripto-1 的真核表達(dá)載體（pCI-n胞，經(jīng)過 G418（濃度為 400 600 μg/mL）的反復(fù)篩選上清，并提取細(xì)胞質(zhì)蛋白，利用 Western blot 方法檢測 Cripto-1 蛋白。如圖2所示，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的胞質(zhì)蛋白中檢測到了Cripto-1則無表達(dá)。并且我們也在收集的細(xì)胞上清液中檢測到了顯示，我們構(gòu)建的這個(gè)穩(wěn)定表達(dá) Cripto-1 的 L02 細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)研究。之后，我們將利用這一細(xì)胞系，研究 Cri控作用。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：2520732