【摘要】：目的:探討ATM對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其調(diào)控機(jī)制。方法:(1)利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌癌旁腫瘤組織(以下簡(jiǎn)稱正常乳腺組織)、侵潤(rùn)、侵潤(rùn)伴轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中p-ATM蛋白的表達(dá);乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞分別經(jīng)常氧(21%O2)和低氧(1%O2)處理后,細(xì)胞免疫熒光和Western Blot檢測(cè)p-ATM和總ATM表達(dá),Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。(2)利用sh RNA技術(shù)和ATM特異性抑制劑Ku60019抑制乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞中ATM功能,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。(3)BT549細(xì)胞Ku60019處理組和溶劑對(duì)照組做磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析,利用DAVID軟件對(duì)靶蛋白進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路富集分析,篩選與遷移和侵襲相關(guān)的靶蛋白。(4)利用IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶基因與ATM相互作用并受其調(diào)控,采用sh RNA技術(shù)敲低靶蛋白,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。(5)利用定點(diǎn)突變技術(shù),Transwell實(shí)驗(yàn),IP實(shí)驗(yàn),細(xì)胞應(yīng)力纖維染色技術(shù)驗(yàn)證靶蛋白特異性磷酸化位點(diǎn)功能。結(jié)果:(1)隨著乳腺腫瘤分級(jí)的增加,p-ATM蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng);與常氧組相比,低氧處理后p-ATM表達(dá)量顯著增加,細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。(2)ATM敲低或抑制后,細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下調(diào)。(3)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示,ATM下游靶蛋白主要參與細(xì)胞間粘附過(guò)程,調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等信號(hào)通路。結(jié)合文獻(xiàn)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)選擇與遷移侵襲相關(guān)的靶蛋白為CTTN,其特異性磷酸位點(diǎn)為S113。(4)IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)ATM可以磷酸化CTTN S113位點(diǎn),敲低CTTN的表達(dá),乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下調(diào)。(5)利用定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CTTN S113位點(diǎn)磷酸化可以促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲。進(jìn)一步通過(guò)IP實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞應(yīng)力纖維染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CTTN S113位點(diǎn)磷酸化可以通過(guò)結(jié)合Arp2/3復(fù)合體促進(jìn)細(xì)胞F-actin應(yīng)力纖維形成。結(jié)論:低氧活化的ATM可以通過(guò)磷酸化CTTN S113位點(diǎn)調(diào)控Arp2/3復(fù)合體介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白聚合促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。
文內(nèi)圖片：
圖片說(shuō)明：低氧活化ATM促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲（A）免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)乳腺正常組織和乳腺癌組織中p-ATM表達(dá)量
[Abstract]:Objective: to investigate the effect of ATM on migration and invasion of breast cancer cells and its regulatory mechanism. Methods: (1) Immunohistochemical method was used to detect the expression of p-ATM protein in paracancerous tumor tissues (hereinafter referred to as normal breast tissues) and invasion and metastasis of breast cancer tissues. After breast cancer BT549 and MDA-MB-231 cells were treated with regular oxygen (21%O2) and hypoxia (1%O2), the expression of p-ATM and total ATM was detected by immunofluorescence and Western Blot, and the migration and invasion of breast cancer cells were detected by Transwell assay. (2) sh RNA technique and Ku60019, a specific inhibitor of ATM, were used to inhibit ATM function in BT549 and MDA-MB-231 cells of breast cancer. The ability of cell migration and invasion was detected by Transwell assay. (3) Phosphorylation proteome analysis was performed in Ku60019 treatment group and solvent control group of BT549 cells, GO and KEGG signal pathways were enriched and analyzed by DAVID software, and the target proteins related to migration and invasion were screened. (4) the interaction between target gene and ATM was verified by IP assay, and the target protein was knocked down by sh RNA technique. Transwell assay was used to detect cell migration and invasion. (5) site-directed mutagenesis, Transwell test, IP test and cell stress fiber staining were used to verify the function of specific phosphorylation sites of target proteins. Results: (1) with the increase of breast tumor grade, the expression of p-ATM protein increased gradually. Compared with normoxic group, the expression of p-ATM increased significantly and the ability of cell migration and invasion increased significantly after hypoxia treatment. (2) after ATM knockdown or inhibition, the ability of cell migration and invasion was significantly down-regulated. (3) the results of phosphorylation proteome analysis showed that the downstream target protein of ATM was mainly involved in the process of cell adhesion and regulated actin cytoskeleton and other signaling pathways. Combined with literature and mass spectrometry data, the target protein related to migration and invasion was selected as CTTN, and its specific phosphate site was S113. (4) IP assay confirmed that ATM could phosphorylation CTTN S113 site, knock down the expression of CTTN, and significantly down-regulate the migration and invasion of breast cancer cells. (5) site-directed mutation assay showed that CTTN S113 phosphorylation could promote the migration and invasion of breast cancer cells. Furthermore, IP assay and cell stress fiber staining showed that phosphorylation of CTTN S113 site could promote the formation of F-actin stress fibers by binding Arp2/3 complex. Conclusion: hypoxia activated ATM can regulate Arp2/3 complex mediated actin polymerization through phosphorylation of CTTN S113 site to promote the migration and invasion of breast cancer cells.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2510334