【摘要】：背景:結(jié)腸癌是人類(lèi)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和致死率逐年上升,正嚴(yán)重的威脅著人類(lèi)的健康。結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的研究有助于發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志和治療靶點(diǎn)。近些年許多研究表明,miRNA的改變對(duì)于結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此,miRNA是結(jié)腸癌早期診斷和治療及患者預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在標(biāo)志物,更有可能成為結(jié)腸癌分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)。目的:通過(guò)臨床病例研究探討miR-544與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其作為分子標(biāo)志物預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者預(yù)后的臨床價(jià)值。通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-544在結(jié)腸癌中的功能作用,并試闡明miR-544調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制。方法:1.采用RT-qPCR方法檢測(cè)20例配對(duì)的結(jié)腸癌旁正常組織以及85例結(jié)腸癌組織中miR-544表達(dá)水平,采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較miR-544在癌組織及正常組織中的表達(dá)水平的差異,卡方檢驗(yàn)比較結(jié)腸癌患者原發(fā)組織中miR-544的表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床病理因素的關(guān)系,Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)腸癌患者組織中miR-544的表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者總生存(overall Survival,OS)的關(guān)系,Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)價(jià)miR-544作為預(yù)后預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物的臨床價(jià)值;2.采用RT-q PCR方法檢測(cè)不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-544的表達(dá)水平,分選擇出miR-544高表達(dá)和低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞系;3.轉(zhuǎn)染miR-544 mimics和miR-544 inhibitor分別使結(jié)腸癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-544和沉默內(nèi)源性miR-544表達(dá),通過(guò)MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察miR-544對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)觀察miR-544對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;4.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-544表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響,通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白pRb和Cyclin D1表達(dá)水平;5.通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-544下游調(diào)控的靶基因,通過(guò)和雙熒光酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)分析miR-544對(duì)下游潛在靶基因FOXO1的調(diào)節(jié)活性,通過(guò)RT-q PCR和Western blot檢測(cè)miR-544對(duì)FOXO1表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1.miR-544在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于配對(duì)癌旁正常組織(P0.001);miR-544高表達(dá)率在高/中分化的組織學(xué)分級(jí)較低分化組顯著降低(P=0.047),且在淋巴結(jié)呈陽(yáng)性的結(jié)腸癌患者組中顯著高于淋巴結(jié)呈陰性的結(jié)腸癌患者組(P=0.005);miR-544高表達(dá)的結(jié)腸癌患者較低表達(dá)患者預(yù)后差(P=0.018),但miR-544表達(dá)水平不是預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P=0.117);2.miR-544在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中高表達(dá),在結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中低表達(dá);3.在HT29細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-544能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,在HCT116細(xì)胞中沉默miR-544表達(dá)能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力;4.在HT29結(jié)腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-544能促進(jìn)細(xì)胞周期G1至S期轉(zhuǎn)換,伴隨pRb和Cyclin D1表達(dá)上調(diào),在HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中降表達(dá)miR-544能導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯,伴隨pRb和Cyclin D1表達(dá)下調(diào);5.通過(guò)序列比對(duì)預(yù)測(cè)miR-544下游調(diào)控的靶基因,結(jié)果顯示FOXO1 3’-UTR區(qū)含有miR-544潛在的結(jié)合位點(diǎn);雙熒光報(bào)告系統(tǒng)證明miR-544能降低FOXO1 3’-UTR的活性;進(jìn)一步結(jié)合位點(diǎn)突變技術(shù)發(fā)現(xiàn),miR-544不能降低miR-544結(jié)合位點(diǎn)突變的FOXO1 3’-UTR活性,在HT29結(jié)腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-544能降低FOXO1 m RNA和蛋白的表達(dá)水平,在HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中降表達(dá)miR-544能上調(diào)FOXO1 m RNA和蛋白的表達(dá)水平。6.在HT29結(jié)腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-544使mTOR、PI3K和AKT的磷酸化水平提高,而同時(shí)外源過(guò)表達(dá)FOXO1能下調(diào)mTOR、PI3K和AKT的磷酸化水。結(jié)論:1.miR-544高表達(dá)是結(jié)腸癌患者早發(fā)轉(zhuǎn)移和分化差的分子標(biāo)志,且可預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者預(yù)后;2.miR-544通過(guò)抑制FOXO1表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力;3.miR-544通過(guò)調(diào)控FOXO1表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程。4.miR-544通過(guò)調(diào)控FOXO1表達(dá),影響PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.35

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8 宋e，

本文編號(hào)：2410563