【摘要】：宮頸癌(Cervical cancer,CC)是女性常見惡性腫瘤,發(fā)病率在全世界女性腫瘤中位居第二位,僅次于乳腺癌。全世界每年新增病例約50萬,死亡病例約30萬,而我國CC發(fā)病率位居世界第二位,且發(fā)病年齡日漸年輕化,嚴重威脅全球女性生命健康。盡管目前對CC的診治取得了較大進步,但CC患者的預(yù)后和死亡率并沒有得到明顯的改善。早期的CC患者通過手術(shù)治療可以達到較好的預(yù)后,而晚期CC患者5年的生存率只有50%左右,治療效果不佳。其它治療手段包括化療和放療,但均缺乏特異性,同時具有嚴重的毒副作用。因此深入探討CC發(fā)生發(fā)展的病理機制,尋求更好、更有效的治療方案對CC的臨床防治具有重大意義。e IF5A2基因是e IF5A家族的同源基因之一,定位在染色體3q26.2區(qū),在細胞生長、分化、增殖、凋亡等過程中扮演重要角色。既往研究表明,在卵巢癌、肝癌、膀胱癌及食管鱗狀細胞癌等多種實體瘤組織中存在e IF5A2異常表達,并作為腫瘤惡性程度高的標志物之一。而e IF5A2沉默能夠有效抑制腫瘤細胞惡性增殖、促進細胞凋亡,降低其侵襲轉(zhuǎn)移能力。近年研究發(fā)現(xiàn),e IF5A2在宮頸癌組織中的表達顯著升高,且與FIGO分期、淋巴血管侵犯、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)高度相關(guān),但其在宮頸癌中的具體分子調(diào)控機制尚不明確,因此e IF5A2對宮頸癌細胞生物學功能的影響仍需進一步探索。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),Rho A/ROCK信號通路在多種腫瘤中持續(xù)性激活,且與腫瘤細胞生長、凋亡、侵襲遷移及惡性進展密切相關(guān)。另有研究證實,e IF5A2基因通過調(diào)控Rho A/ROCK信號通路相關(guān)蛋白表達介導胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移。此外,e IF5A2過表達促進肝癌細胞增殖和遷移的同時顯著激活Rho A/Rac1信號通路。表明e IF5A2可以通過調(diào)控Rho A/ROCK信號通路活性介導腫瘤細胞的增殖和遷移。但e IF5A2在宮頸癌中是否通過Rho A/ROCK信號通路影響腫瘤細胞的生物學活性尚不清楚。本研究采用real-time PCR和western blot分析了e IF5A2表達與CC的相關(guān)性;并應(yīng)用RNA干擾技術(shù)降低e IF5A2在宮頸癌Hela細胞中的表達,結(jié)合MTT、流式細胞術(shù)、克隆形成、劃痕實驗及Transwell等實驗觀察e IF5A2基因干擾對CC細胞增殖周期和遷移的影響;為探討相關(guān)的分子機制,本研究檢測了Rho A及ROCK在CC組織中的表達,并通過構(gòu)建Rho A過表達載體及干擾片段研究Rho A異常表達對CC細胞增殖和遷移的影響;最后在e IF5A2基因干擾基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染Rho A過表達載體,深入探討e IF5A2基因?qū)ho A/ROCK信號通路的調(diào)控作用,明確e IF5A2基因在CC發(fā)病、進展中的作用和具體分子機制。本研究結(jié)果旨在進一步闡明CC的發(fā)病機理,并為宮頸癌臨床防治提供新型分子靶點和更多理論依據(jù)。1.e IF5A2在宮頸癌組織中的表達分析目的:分析e IF5A2在CC組織和癌旁正常組織中是否存在差異表達,論證e IF5A2基因同CC發(fā)病存在相關(guān)性。方法:采集15對CC和對應(yīng)的癌旁正常組織樣本,real-time PCR技術(shù)檢測各樣本中e IF5A2 m RNA表達,western blot技術(shù)檢測各樣本中e IF5A2蛋白表達,分別從m RNA和蛋白水平分析e IF5A2與CC發(fā)病的關(guān)系。結(jié)果:同癌旁正常組織樣本比較,e IF5A2 m RNA和蛋白在CC組織樣本中的表達均顯著升高,且差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論:成功證實e IF5A2在CC組織中異常高表達,進一步明確了e IF5A2可能成為人類腫瘤病理診斷的重要分子標志和臨床治療的潛在分子靶點。并為應(yīng)用Real-time PCR或免疫組化技術(shù)分析e IF5A2在宮頸活檢組織中的表達進行CC病理診斷奠定了一定的理論基礎(chǔ)。2.e IF5A2基因干擾對宮頸癌細胞增殖、遷移的影響目的:明確e IF5A2基因干擾對Hela細胞增殖和遷移的影響。方法:通過構(gòu)建e IF5A2干擾載體,轉(zhuǎn)染Hela細胞并采用G418篩選e IF5A2穩(wěn)定干擾細胞。實驗設(shè)計:空白對照組(Control)、陰性對照組(NC)和e IF5A2-sh RNA干擾組(she IF5A2)。通過MTT實驗檢測e IF5A2干擾對Hela細胞增殖的影響;PI單染流式細胞術(shù)分析各組細胞周期變化;克隆形成實驗觀察各組細胞增殖能力;劃痕實驗及Transwell實驗檢測各組細胞遷移能力。結(jié)果:e IF5A2基因干擾后,MTT檢測結(jié)果顯示細胞增殖能力顯著下降(p0.05);流式細胞術(shù)檢測細胞周期結(jié)果顯示G0期細胞比例增加,S期和G2期細胞比例明顯減少(p0.05或p0.01);細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示細胞克隆形成率顯著降低(p0.05);劃痕實驗及Transwell實驗結(jié)果顯示細胞遷移能力顯著減弱(p0.05)。結(jié)論:e IF5A2基因干擾能將Hela細胞阻滯于G0期,有效抑制細胞增殖和細胞遷移。3.e IF5A2基因影響宮頸癌細胞增殖、遷移的分子機制目的:(1)分析Rho A表達與CC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,明確Rho A過表達或干擾對CC細胞增殖和遷移的影響。(2)明確e IF5A2基因干擾對CC細胞中Rho A/ROCK信號通路活性的影響以及e IF5A2基因是否通過調(diào)控Rho A/ROCK通路介導Hela細胞增殖和遷移。方法:(1)采集46例CC和34例宮頸炎組織樣本,Western blot技術(shù)檢測Rho A及ROCK在各組織樣本中的表達,分析Rho A同患者年齡、腫瘤體積、HPV感染、FIGO分期、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體及孕激素受體的相關(guān)性;構(gòu)建Rho A過表達及干擾片段,分別轉(zhuǎn)染Hela細胞。實驗設(shè)計:A空白對照組(Hela)、B空載對照組(Hela-Con)、C Rho A過表達組(Hela-Rho A+)、D陰性對照組(si RNA-Con)、E Rho A干擾組(si RNA-Rho A)。通過CCK-8實驗檢測Rho A異常表達對CC細胞增殖的影響,劃痕實驗檢測細胞遷移能力變化。(2)western blot檢測Control組、NC組和she IF5A2組中Rho A、ROCKⅠ和ROCKⅡ的表達,驗證e IF5A2基因干擾對Rho A/ROCK通路具有調(diào)控作用后,構(gòu)建Rho A過表達載體并轉(zhuǎn)染e IF5A2基因穩(wěn)定干擾的Hela細胞,實驗設(shè)計:NC組、she IF5A2組、she IF5A2+空載轉(zhuǎn)染組(Vector)和she IF5A2+Rho A過表達組(Rho A)。通過MTT實驗檢測Rho A過表達對e IF5A2干擾細胞增殖能力的影響,劃痕實驗分析各組細胞遷移能力變化。結(jié)果:(1)與對照組比較,Rho A、ROCKⅠ和ROCKⅡ在CC組織中的表達顯著增加(p0.05或p0.01),且同F(xiàn)IGO、血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān);Rho A過表達后,CCK-8實驗結(jié)果顯示細胞增殖能力顯著增加(p0.05或p0.01),劃痕實驗結(jié)果顯示Hela細胞遷移能力顯著增強(p0.01),而干擾Rho A能有效抑制細胞增殖和遷移(p0.05)。(2)western blot結(jié)果顯示e IF5A2基因干擾后Rho A、ROCKⅠ、ROCKⅡ的表達顯著降低(p0.05);在e IF5A2基因干擾基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染Rho A過表達載體后,同she IF5A2組比較,MTT和劃痕實驗檢測結(jié)果顯示Rho A過表達部分逆轉(zhuǎn)了e IF5A2干擾對Hela細胞的調(diào)控作用,Hela細胞的增殖和遷移能力均顯著上升,且差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論:(1)Rho A在宮頸癌組織中異常高表達,且同腫瘤臨床分期和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),Rho A過表達顯著促進宮頸癌細胞增殖和遷移。(2)e IF5A2基因通過激活Rho A/ROCK信號通路,增加Rho A、ROCKⅠ、ROCKII的表達誘導Hela細胞增殖,促進細胞遷移。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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本文編號：2396528