【摘要】：第一章miR-200及其靶基因TCF12和Fli-1通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌CAFs細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移目的:探索miR-200s使CAF活化,調(diào)控ECM蛋白的異常沉積,并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。方法:(1)原代分離獲得乳腺癌病人來(lái)源的正常成纖維細(xì)胞(NF:Normal fibroblast)和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF:Cancer-associated fibroblast)。(2)qRT-PCR檢測(cè)這20對(duì)NF和CAF細(xì)胞中miR-200s的表達(dá)。(3)利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng),將乳腺癌細(xì)胞與NF細(xì)胞共培養(yǎng),qRT-PCR檢測(cè)miR-200s的表達(dá)。(4)qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)確定miR-200s的靶基因。(5)利用sh RNA和基因過(guò)表達(dá)技術(shù),驗(yàn)證miR-200s及其靶基因促進(jìn)CAF的活化。(6)利用膠收縮、qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-200s及其靶基因?qū)CM重塑的影響(7)癌細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤模型驗(yàn)證miR-200s及其靶基因促對(duì)乳癌轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果:(1)原代培養(yǎng)獲得20對(duì)成對(duì)的乳腺癌病人來(lái)源的NF和CAF細(xì)胞。(2)qRT-PCR結(jié)果顯示miR-200s在CAF中下調(diào)的真實(shí)性和普遍性。(3)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)癌細(xì)胞共培養(yǎng)激活的NF細(xì)胞中miR-200s表達(dá)下調(diào)。(4)qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明TCF12和Fli-1分別是miR-141和miR-200b的靶基因。(5)利用sh RNA和基因過(guò)表達(dá)技術(shù),發(fā)現(xiàn)低表達(dá)miR-200s的NFs具有活化的CAFs的特征,CAF活化標(biāo)志物a-SMA、FAP表達(dá)增加,其遷移侵襲能力增強(qiáng);CAFs中恢復(fù)miR-200s的表達(dá),部分抑制CAF功能并出現(xiàn)NF表型特征。(6)利用膠收縮、qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-200s及其靶基因通過(guò)調(diào)控下游一系列ECM成分相關(guān)基因,尤其是FN和LOX的表達(dá),促進(jìn)ECM重塑。(7)體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)和臨床病例研究更進(jìn)一步證實(shí)miR-200s及其靶基因?qū)AF活化、ECM重塑、乳癌轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)論:(1)下調(diào)的miR-200s導(dǎo)致細(xì)胞分化相關(guān)的靶轉(zhuǎn)錄因子Fli-1和TCF12異常表達(dá),促進(jìn)乳腺癌CAFs活化。(2)miR-200s及其靶基因Fli-1和TCF12介導(dǎo)了乳癌微環(huán)境ECM重塑,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。揭示CAFs促進(jìn)乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的新的分子機(jī)制,為靶向腫瘤微環(huán)境的治療提供新靶點(diǎn)。第二章離體CAFs活化的自我維持目的:探索miR-200s維持CAF的活化狀態(tài)及機(jī)制。方法:(1)5’-aza處理CAF細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)miR-200s的表達(dá)。(2)Western Blot檢測(cè)成對(duì)NF和CAF細(xì)胞中甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)差異。(3)利用基因干擾技術(shù),沉默CAF細(xì)胞中Dnmt3b的表達(dá),qRT-PCR檢測(cè)miR-200s的表達(dá)。(4)qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶驗(yàn)證miR-200b/200c的靶基因Dnmt3b。(5)TGF-b1處理CAF后,qRT-PCR檢測(cè)miR-200s的表達(dá),Western Blot檢測(cè)Dnmt3b及miR-200s的靶基因TCF12和Fli-1的表達(dá)。結(jié)果:(1)5’-aza處理CAF細(xì)胞,qRT-PCR發(fā)現(xiàn)miR-200s表達(dá)增加。(2)Western Blot結(jié)果顯示CAF細(xì)胞中Dnmt3b表達(dá)明顯高于NFs。(3)qRT-PCR結(jié)果顯示沉默CAF細(xì)胞中Dnmt3b的表達(dá),miR-200s表達(dá)增加。(4)qRT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶結(jié)果顯示Dnmt3b是miR-200b/200c的靶基因。(5)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)TGF-b1處理CAF細(xì)胞,qRT-PCR結(jié)果顯示miR-200s下調(diào),撤離外源性TGF-b1并正常培養(yǎng)CAF細(xì)胞,miR-200s持續(xù)低表達(dá);而Western Blot結(jié)果顯示Dnmt3b表達(dá)增加,同時(shí)靶基因TCF12和Fli-1的表達(dá)也增加。結(jié)論:(1)CAF細(xì)胞中,Dnmt3b高表達(dá),并可能通過(guò)基因甲基化使miR-200s表達(dá)下調(diào)。(2)CAF細(xì)胞中,Dnmt3b與miR-200s形成反饋調(diào)控環(huán),維持CAF活化。(3)TGF-b1參與調(diào)節(jié)Dnmt3b-miR-200s環(huán)路,促進(jìn)并維持CAF活化。(4)Dnmt3b與TGF-b1形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán),維持CAF的活化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2361289