【摘要】：【背景】肝細(xì)胞肝癌是預(yù)后較差的一類腫瘤,其致死率居所有腫瘤的第三位。肝細(xì)胞肝癌的致病因素十分復(fù)雜,主要包括病毒、真菌感染、酒精等因素導(dǎo)致基因突變,原癌基因激活,抑癌基因沉默。近十幾年來的研究表明,腫瘤的發(fā)生發(fā)展并不僅僅是腫瘤細(xì)胞本身癌基因或是抑癌基因的改變,腫瘤周圍的微環(huán)境同樣作為 共犯‖參與了腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。腫瘤的微環(huán)境中主要的細(xì)胞種類可以分為3類:血管生成細(xì)胞,浸潤的免疫細(xì)胞,腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞。這三類細(xì)胞均能夠與腫瘤細(xì)胞通過相互作用,參與對腫瘤細(xì)胞 腫瘤印記‖的改變過程。腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中一類重要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,高表達(dá)alpha-SMA和纖維活化蛋白FAP,分泌多種細(xì)胞因子如HGF,EGF,IGF,FGF,SDF-1等參與腫瘤細(xì)胞增殖和EMT轉(zhuǎn)化過程,并能夠通過分泌大量的基質(zhì)成分、膠原和纖黏連蛋白等參與腫瘤微環(huán)境的重塑。外泌體是一種直徑在30-150nm的囊泡結(jié)構(gòu),其中包含多種內(nèi)容物,如蛋白質(zhì)(細(xì)胞因子,膜受體,受體的配體等等),核酸類物質(zhì)(如DNA,mRNA,miRNA,LncRNA)以及脂質(zhì),其組成成分能夠影響受體靶細(xì)胞。近年來的研究表明,腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞能夠通過分泌外泌體與腫瘤細(xì)胞相互交流。而腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞與正常成纖維細(xì)相比其miRNA的表達(dá)譜差異十分明顯。那么腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞來源的外泌體中miRNAs是否同樣存在不同的表達(dá)豐度,是否參與調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的改變?【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.探討肝癌組織中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與癌旁組織中成纖維細(xì)胞來源外泌體中的miRNAs的差異表達(dá)情況,并篩選出候選miRNA進(jìn)行功能學(xué)驗(yàn)證2.探討差異表達(dá)的miR-320a對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)表型的影響3.研究miR-320a參與調(diào)控肝癌細(xì)胞惡性改變的分子機(jī)制【實(shí)驗(yàn)方法】1.首先分離6對肝癌及癌旁組織中原代的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)和癌旁成纖維細(xì)胞(PAFs),通過提取兩種成纖維細(xì)胞分泌的外泌體,通過PCR擴(kuò)增獲取最終的Cdna文庫,進(jìn)而對其中的miRNAs進(jìn)行miRNAs測序后篩選出了差異表達(dá)的miRNA。2.通過體外共培養(yǎng)和體內(nèi)裸鼠皮下成瘤,在CAFs中過表達(dá)miR-320a,觀察是否能夠通過外泌體傳遞至肝癌細(xì)胞并發(fā)揮功能。3.利用慢病毒在肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR-320a,通過CCK-8,平板克隆,Transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,miR-320a對肝癌細(xì)胞生物學(xué)表型的影響。4.通過體內(nèi)皮下成瘤實(shí)驗(yàn),檢測mi R-320a對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響;通過裸鼠尾靜脈,檢測miR-320a對肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移能力的影響。5.利用生物信息預(yù)測軟件結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證miR-320a的靶基因。通過western blot,免疫組織化學(xué)和原位雜交試驗(yàn),驗(yàn)證miR-320a下游分子通路。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.成功分離培養(yǎng)了肝癌組織來源的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)及癌旁組織成纖維細(xì)胞(PAFs),并對其生物學(xué)特征及表面分子標(biāo)記進(jìn)行了驗(yàn)證。相對于PAFs,CAFs細(xì)胞表達(dá)更強(qiáng)的alpha-SMA和FAP,但是PDGF-beta的表達(dá)并無明顯的差異。成功分離了CAFs及PAFs細(xì)胞分泌的外泌體,并對其進(jìn)行了鑒定。通過構(gòu)建miRNAs文庫,進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明CAFs來源的外泌體中存在大量下調(diào)的促腫瘤miRNAs。共有42個(gè)下調(diào),2個(gè)上調(diào)miRNA存在顯著性差異,通過比較差異表達(dá)的miRNAs的表達(dá)量及差異倍數(shù),最終篩選出miR-320a作為后續(xù)研究。2.通過體外間接共培養(yǎng)模型證實(shí),成纖維細(xì)胞能夠?qū)y3標(biāo)記的mi R-320a通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)至肝癌細(xì)胞,在肝癌細(xì)胞中表達(dá)紅色熒光。將過表達(dá)miR-320a的成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng),qRT-PCR結(jié)果提示,MHCC97-H細(xì)胞中miR-320a的表達(dá)上調(diào)。同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),過表達(dá)miR-320a的成纖維細(xì)胞能夠在體抑制肝癌細(xì)胞的成瘤,小動(dòng)物活體成像結(jié)果提示熒光強(qiáng)度明顯低于對照組。3.通過CCK-8、平板克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)mi R-320a后能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力;miR-320a能夠是肝癌細(xì)胞系細(xì)胞周期阻滯于G1期。通過Transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)miR-320a后能夠抑制肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。進(jìn)一步裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),及裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型證實(shí)了體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。4.利用生物分析軟件(TargetScan,CLIP-Seq,miRDB and miRanda)預(yù)測了miR-320a的下游靶基因PBX3。通過恢復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證實(shí),miR-320a能夠通過PBX3參與調(diào)控肝癌細(xì)胞MHCC97-H和SMM7721的增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移能力。進(jìn)一步證實(shí),PBX3可以通過影響ERK1/2磷酸化水平,參與調(diào)節(jié)了CDK2,MMP2以及EMT的相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)。綜上,我們認(rèn)為腫瘤組織中CAFs分泌外泌體中的miR-320a表達(dá)下降,會引起其中的促腫瘤成分和抑腫瘤成分的平衡失調(diào),為肝癌細(xì)胞提供了更有利于其生長轉(zhuǎn)移的環(huán)境,進(jìn)而介導(dǎo)肝癌的惡性轉(zhuǎn)變。而通過在CAFs中過表達(dá)miR-320a能夠有效抑制腫瘤的發(fā)展,這為肝癌的治療提供了一個(gè)可能的方法。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7
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本文編號：2254856