發(fā)布時(shí)間：2018-07-18 09:12

【摘要】：第一部分構(gòu)建一種新型的絲素蛋白生物支架用于胃癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)目的:腫瘤細(xì)胞體外三維培養(yǎng)技術(shù),作為連接腫瘤細(xì)胞二維培養(yǎng)技術(shù)和體內(nèi)動(dòng)物荷瘤模型的橋梁,能夠較好地在體外模擬腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境。這項(xiàng)技術(shù)開辟了一項(xiàng)新的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及研究領(lǐng)域,同時(shí)也是構(gòu)建新型腫瘤體外藥敏實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)擬采用一種溫和無毒的方法,提取桑蠶蠶繭中的絲素蛋白,構(gòu)建一種穩(wěn)定的生物蛋白支架,對(duì)其形貌進(jìn)行表征,并探究其用于胃癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的可行性。方法:在溫和而無毒的條件下,采用脫膠、凍干等步驟,構(gòu)建一種新型的絲素蛋白生物支架,通過掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡對(duì)其形貌進(jìn)行表征;采用熒光染色和HE染色的方法觀察胃癌細(xì)胞株MKN45在其內(nèi)部的生長(zhǎng)情況,同時(shí)評(píng)估該生物支架在培養(yǎng)液中的穩(wěn)定性。結(jié)果:成功地構(gòu)建了一種可用于胃癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的絲素蛋白生物支架。在掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察,其內(nèi)部呈多孔結(jié)構(gòu),孔徑大小介于31.8-108.5μm之間;在利用該支架對(duì)胃癌細(xì)胞株MKN45進(jìn)行培養(yǎng)的第1天、第10天、第21天,分別對(duì)支架內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行熒光染色和鏡下觀察,我們發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)部的細(xì)胞由零散的單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)成為不規(guī)則的三維多細(xì)胞團(tuán);另外,在培養(yǎng)的第21天,對(duì)支架進(jìn)行石蠟包埋切片及HE染色,也證實(shí)了胃癌細(xì)胞株MKN45沿著支架內(nèi)部孔隙呈聚集團(tuán)狀三維生長(zhǎng)。結(jié)論:從桑蠶蠶繭中提取的絲素蛋白是一種很好的生物材料,可用于構(gòu)建一種新型穩(wěn)定的胃癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)模型。第二部分建立一種新型胃癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)膠滴模型及染色—數(shù)字圖像藥敏法目的:采用商品化的鼠尾I型膠原蛋白,構(gòu)建一種穩(wěn)定可靠的胃癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)膠滴模型;基于此模型設(shè)計(jì)“染色—數(shù)字圖像藥敏法”,初步探索其用于后續(xù)體外腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)的可行性。方法:以商品化的鼠尾I型膠原蛋白溶液為原料,制備包裹有人胃癌細(xì)胞株BGC823的膠滴,在光學(xué)顯微鏡下觀察BGC823細(xì)胞株在膠滴中的生長(zhǎng)情況;在培養(yǎng)的第8天,利用中性紅溶液對(duì)鼠尾膠滴中的活細(xì)胞進(jìn)行染色,經(jīng)過固定、洗滌、風(fēng)干等程序后,利用倒置熒光相差顯微鏡獲取膠滴的圖像,Image Pro Plus圖像處理軟件計(jì)算膠滴中染色區(qū)域的積分光密度(Integrated Optical Density,IOD),從而對(duì)膠滴中的活細(xì)胞進(jìn)行定量;我們接著考察了鼠尾膠滴中的活細(xì)胞數(shù)量與該方法計(jì)算出的積分光密度是否存在相關(guān)性;最后我們利用該方法計(jì)算了不同濃度的順鉑對(duì)于胃癌細(xì)胞株BGC823的抑制率。結(jié)果:在光學(xué)顯微鏡下觀察,胃癌細(xì)胞株BGC823在鼠尾膠滴內(nèi)部呈良好的三維生長(zhǎng),因此我們成功構(gòu)建了胃癌細(xì)胞體外三維培養(yǎng)膠滴模型;在利用該模型進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的第8天,采用染色—數(shù)字圖像定量法成功對(duì)膠滴內(nèi)的染色區(qū)域進(jìn)行了積分光密度定量,且證實(shí)了該方法計(jì)算出的積分光密度與膠滴內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)目呈良好的正相關(guān)性;另外,我們觀察到,不同濃度的順鉑作用后的膠滴,其染色的深淺程度不同,我們利用該方法分別計(jì)算了0.2ug/ml和2ug/ml濃度的順鉑對(duì)于BGC823的抑制率。結(jié)論:成功地利用鼠尾I型膠原蛋白構(gòu)建了胃癌細(xì)胞體外三維細(xì)胞培養(yǎng)膠滴模型,完善了基于該模型的染色—數(shù)字圖像藥敏法。該三維培養(yǎng)模型及數(shù)字圖像藥敏法具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:In vitro three - dimensional culture of gastric cancer cell line MKN45 was studied by means of fluorescence staining and HE staining . In this paper , we have successfully constructed three - dimensional gel - drop model for gastric cancer cell line BGC823 by using the method of reversed fluorescence phase contrast microscope , and then we investigated the inhibition rate of cisplatin on gastric cancer cell line BGC823 .
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2131444