本文選題：大腸癌 + 腸道菌群��； 參考：《上海交通大學》2015年博士論文

【摘要】：目的:大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。到目前為止,大腸癌的病因及發(fā)病機制仍不明確,既往研究認為多種因素參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展,包括飲食結(jié)構(gòu)、肥胖、運動以及個人的遺傳因素等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)及其代謝模式的改變可能在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。近來,腸道微生態(tài)改變引起腸癌發(fā)生發(fā)展已引起高度重視,而且已不斷有文獻報道具核梭桿菌在其中的作用。本研究正是基于我國人群特征,探索大腸癌患者的腸道菌群特征性改變,在腸道中尋找類似幽門螺桿菌的特異性致癌細菌并探討其與大腸癌預后的相關性。方法:(1)臨床樣品的收集。新鮮大腸癌(35例)及癌旁正常粘膜樣品(19例)、炎性腸病(包括克隆病和潰瘍型結(jié)腸炎,共20例)粘膜樣品及大腸腺瘤樣品(15例)來自上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心2011年9月至2012年9月的患者,經(jīng)病理組織學證實,大腸癌患者需進一步手術治療。內(nèi)鏡檢查1周(腸道菌群結(jié)構(gòu)基本恢復正常)后收集患者的糞便樣品;同時22例大腸癌患者分為兩組,術前分別口服益生菌制劑(培菲康散劑)和安慰劑一周,術中收集大腸癌粘膜樣品和癌旁正常粘膜樣品,術后一周收集糞便樣品。此外,15例健康志愿者正常腸黏膜樣品和糞便樣品由上海市閘北區(qū)社區(qū)居民提供。所有樣品均符合相應的納入排除標準,并經(jīng)上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者和健康志愿者均簽署志愿者知情同意書。(2)大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)改變的檢測。利用QIAamp DNA試劑盒對標本進行基因組DNA抽提;利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA,對各標本基因組DNA含量進行鑒定;利用ABI GeneAmp對抽提的基因組DNA進行PCR擴增,并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物、繼而熒光定量;利用Roche GS FLX454測序儀對PCR擴增產(chǎn)物的16S rRNA V3可變區(qū)進行焦磷酸測序,通過SILVA數(shù)據(jù)庫將所測序列進行序列比對,并經(jīng)good’s覆蓋率、多樣性指數(shù)、pca、lefse判別分析等多種方法對各組微生物種類進行分類學和多樣性的比較,以期發(fā)現(xiàn)大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異性改變。(3)具核梭桿菌(fusobacteriumnucleatum,fn)和莓實假單胞菌(pseudomonasfragi,pf)的臨床驗證。選擇2007年1月至2011年12月同濟大學附屬第十人民醫(yī)院283例行手術切除的大腸癌石蠟標本。其中,男性患者144例,女性139例,年齡40-80歲,平均年齡67歲。首先進行qrt-pcr檢測,利用mirneasyffpekit(qiagen,217504)試劑盒對上述石蠟樣品脫蠟,并對組織樣品的總rna進行抽提;用逆轉(zhuǎn)錄酶reversetranscriptasem-mlv(d2640a,takara)進行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna;并設計和合成fn和pf菌的引物,最后通過realtimepcr儀進行擴增和定量。我們采用免疫熒光原位雜交技術(fluorescenceinsituhybridization,fish)對大腸癌粘膜表面的fn和pf菌進行定位檢測。(4)fn及pf表達水平與大腸癌預后的相關性分析。采用癌粘膜∶癌旁正常粘膜比值的50百分位數(shù)作為分界點,即將比值高于分界點的病例歸入高fn表達組,而將比值低于分界點的病例歸入低fn表達組。同樣將比值高于分界點的病例歸入高pf表達組,而將比值低于分界點的病例歸入低pf表達組。將pf作為分層指標對fn分層并進一步分析。采用kaplan-meier法及l(fā)ogrank檢驗進行生存分析。采用cox比例風險模型進行大腸癌生存的單因素和多因素分析。(5)益生菌干預對大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。利用qiaampdnamini試劑盒對上述益生菌干預標本進行基因組dna抽提,后續(xù)基因組dna鑒定、pcr擴增、熒光定量、16srrnav3可變區(qū)測序和生物信息學分析方法同前;分組比較大腸癌組與益生菌干預組粘膜表面菌群結(jié)構(gòu)的差異并探討益生菌干預大腸癌腸道菌群的可行性。結(jié)果:(1)焦磷酸測序研究結(jié)果表明,大腸癌患者的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)與健康對照人群相比具有顯著的差異。從門的水平來看,與正常人相比,大腸癌患者粘膜相關菌群中厚壁菌門(firmicutes)和梭桿菌門(fusobacteria)豐度顯著增加,而變形菌門(proteobacteria)豐度明顯下降;雖然擬桿菌門(bacteroidetes)和放線菌門(actinobacteria)在腫瘤組中豐度較高,但兩組間無顯著性差異;在屬水平上,大腸癌病人中l(wèi)actococcus(50.85%vs.25.35%,p=0.007),fusobacterium(10.08%vs.0.01%,p=0.032),escherichia shigella(2.92%vs.0.22%,p=0.004)豐度明顯高于健康人群,而flavobacterium,pedobacter,sphingobacterium,cau-lobacter,brevundimonas,sphingomonas,sphingomonas,acidovorax,buttiauxella,rahnella,acinetobacter,psychrobacter,pseudomonas,stenotro-phomonas,psychrobacter豐度則明顯降低。采用判別分析結(jié)合效應大小模型(lefse),發(fā)現(xiàn)fusobacterium,prevotella及bacteroides構(gòu)成大腸癌患者腸粘膜的“核心菌群”,而pseudomonas和flavobacterium則構(gòu)成健康人群的“核心菌群”。糞便樣品具有與粘膜組織完全不同的菌群結(jié)構(gòu),主要表現(xiàn)在大腸癌患者的糞便firmicutes菌和bacteroidetes菌豐度明顯降低,而proteobacteria和actinobacteria豐度則明顯升高,fusobacteria在兩組中豐度都較低,差異沒有顯著性。對大腸癌患者的癌組織、癌旁組織及糞便樣品三者間的菌群結(jié)構(gòu)進行了比較,發(fā)現(xiàn)它們之間也存在明顯差異,bacteroidetes在癌旁粘膜上豐度最高,proteobacteria在糞便樣品中豐度最高,fusobacteria則在腫瘤粘膜上豐度最高,firmicutes在三者間的豐度逐漸降低,但差異沒有顯著性。本研究結(jié)果表明,正常人腸道內(nèi)存在兩個“核心菌群”,一個位于大腸粘膜,即粘膜相關“核心菌群”,可能主要通過與腸上皮直接接觸發(fā)揮作用;另一個位于腸腔內(nèi),即“腸腔相關核心菌群”,可能主要通過代謝調(diào)節(jié)腸道功能。正常情況下,這兩個“核心菌群”對維持健康的腸道功能發(fā)揮重要的作用,而“核心菌群”結(jié)構(gòu)的偏移與大腸癌的發(fā)生關系密切。(2)本研究對大腸癌差異菌fusobacterium和pseudomonas兩種菌與細菌庫進行比對,從種的水平篩選出的差異菌分別為fusobacteriumnuclea-tum(fn)和pseudomonasfragi(pf)。qrt-pcr結(jié)果顯示fn在大腸癌粘膜表面富集,而pf則豐度明顯降低,與前期的實驗結(jié)果一致;其次,fish結(jié)果證實部分fn可侵入粘膜固有層,提示fn可能參與大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。(3)單因素和多因素預后分析結(jié)果顯fn表達情況是影響結(jié)腸癌患者生存的獨立預后因素(hr=1.71,p=0.039),而pf表達水平與大腸癌預后關系不明顯,但以pf作為分層指標對fn進一步分層后發(fā)現(xiàn)fn對預后的影響更大,說明fn和pf的表達情況可以作為一個有價值的分子標記物。(4)益生菌干預研究結(jié)果顯示,口服益生菌能明顯改善大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu),并特異性降低具有潛在治病性的Fn菌豐度,初步顯示出對大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)整能力。結(jié)論:大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生特征性改變,主要表現(xiàn)在核心菌群結(jié)構(gòu)的改變,以Fn和Pf為代表的核心菌群可能參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程;同時,Fn在腫瘤局部的表達情況與大腸癌患者預后密切相關,Fn高表達伴隨Pf的高表達預示著預后較差的;此外,益生菌干預能明顯改變大腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu),降低Fn豐度。提示Fn及Pf可作為大腸癌風險篩查、治療策略和預后預測的一個潛在性指標。此外,通過腸道益生菌干預可作為預防和治療大腸癌的一個可行性方案。
[Abstract]:Objective : Colorectal cancer is one of the most common malignant tumors of the digestive tract . So far , the etiology and pathogenesis of colorectal cancer are not clear . In recent years , it has been found that the changes of gut microecology and its metabolic pattern may play an important role in the development of colorectal cancer . ( 3 ) The clinical verification of the expression of fn and pf was carried out by means of fluorescence in situ hybridization ( RT - PCR ) . (5)鐩婄敓鑿屽共棰勫澶ц偁鐧屾?zhèn)ｈ�呰偁閬撹弻緹ょ粨鏋勭殑褰卞搷.鍒╃敤qiaampdnamini璇曞墏鐩掑涓婅堪鐩婄敓鑿屽共棰勬爣鏈繘琛屽熀鍥犵粍dna鎶芥彁,鍚庣畫鍩哄洜緇刣na閴村畾,pcr鎵╁,鑽у厜瀹氶噺,16srrnav3鍙彉鍖烘祴搴忓拰鐢熺墿淇℃伅瀛﹀垎鏋愭柟娉曞悓鍓，

本文編號：1980464