本文選題：肝細(xì)胞癌 + Sox9��； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究目的及背景肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是肝癌中的一種類型,是常見(jiàn)的惡性腫瘤[1],其生物學(xué)行為較為惡性,但由于肝臟較強(qiáng)的代償能力,在疾病早期并沒(méi)有顯著的癥狀,發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤常常已經(jīng)處于進(jìn)展期,由于根治性手術(shù)治療,包括肝移植和肝腫瘤切除術(shù)或射頻消融只適用于部分早期患者[2],中晚期患者缺乏有效的治療手段,故HCC的死亡率居各類腫瘤死亡率的前列。在我國(guó),肝細(xì)胞癌多繼發(fā)于乙型肝炎病毒感染,丙型肝炎所致的肝細(xì)胞癌近年來(lái)比例有所增加。據(jù)報(bào)道[3],對(duì)于患有病毒性肝炎的病人,其HCC的發(fā)病率是正常人群的20倍。失去手術(shù)機(jī)會(huì)的肝癌病人缺乏有效的治療手段,化療藥物對(duì)于進(jìn)展期HCC的作用并不十分理想。索拉菲尼是一類新型靶向治療HCC的藥物[4],其通過(guò)抑制RAF-1、B-RAF的絲/蘇氨酸激酶活性直接抑制腫瘤生長(zhǎng),并且通過(guò)FLT-3、VGFR-2、VEGF-3、PDGF-β、KIT等多種受體的酪氨酸激酶活性來(lái)抑制腫瘤內(nèi)血管生長(zhǎng)從而間接達(dá)到抑制腫瘤的目的[9]。但無(wú)論是索拉菲尼或化療藥物,HCC的耐藥性一直是阻礙其療效的重要因素,許多文獻(xiàn)報(bào)道HCC對(duì)于藥物的耐藥性與腫瘤干細(xì)胞息息相關(guān)。例如Ep CAM陽(yáng)性的腫瘤干細(xì)胞可以介導(dǎo)HCC對(duì)于索拉菲尼的耐藥,Oct4陽(yáng)性的HCC細(xì)胞可以產(chǎn)生對(duì)多柔比星的耐藥[5、6]。在HCC中腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志有許多,包括Ep CAM,CD90,CD133,Oct4,Nanog等,Sox9近年來(lái)亦被認(rèn)為是HCC中腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志之一,Sox9基因最初被發(fā)現(xiàn)參與性別形成步驟、軀干的發(fā)育及器官的成熟[7],并且最近亦被發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在多種腫瘤中升高。Sox9表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞顯示出腫瘤干細(xì)胞的特性,其促進(jìn)腫瘤的增殖,并且增強(qiáng)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,并可促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新[12]。此外Sox9通過(guò)Wnt、Notch、TGF-β通路影響腫瘤的發(fā)生及分化[13],通過(guò)Notch通路及Numb蛋白促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新及增殖[8]。研究發(fā)現(xiàn),癌組織高表達(dá)Sox9的肝癌患者預(yù)后更差[11]。故在此,我們希望探索Sox9是否參與HCC對(duì)索拉菲尼耐藥的過(guò)程,并且探索Sox9調(diào)控HCC對(duì)索拉菲尼耐藥的具體生物學(xué)機(jī)制,從而為解決HCC對(duì)索拉菲尼耐藥提供潛在的方法,豐富進(jìn)展期HCC治療的手段,從而改善一部分臨床患者的預(yù)后。研究方法與結(jié)果第一部分探討肝細(xì)胞癌細(xì)胞在使用索拉菲尼后SOX9的表達(dá)情況。在這一個(gè)部分里,我們使用SMMC-7721及LM3的肝癌細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng),并使用濃度為4μM的索拉菲尼對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理,并于0小時(shí),12小時(shí),24小時(shí),36小時(shí),48小時(shí),60小時(shí)以及72小時(shí)提取細(xì)胞RNA及蛋白,并設(shè)計(jì)Sox9特異性q PCR引物進(jìn)行定量PCR檢測(cè),使用Sox9特異性抗體通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白含量的檢測(cè)。此外使用多聚甲醛固定使用4μM索拉菲尼培養(yǎng)0小時(shí),24小時(shí),48小時(shí)的細(xì)胞,進(jìn)行免疫熒光及流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。結(jié)果:1、在使用4μM的索拉菲尼進(jìn)行培養(yǎng)后,兩種肝癌細(xì)胞系的Sox9表達(dá)無(wú)論在轉(zhuǎn)錄水平或是蛋白水平均呈上升趨勢(shì);2、免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在隨著使用索拉菲尼培養(yǎng)時(shí)間的增加,Sox9在核內(nèi)的表達(dá)上升。3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,細(xì)胞中Sox9陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量顯著增加。第二部分研究Sox9表達(dá)及干擾對(duì)于肝細(xì)胞癌對(duì)索拉菲尼耐藥的影響我們首先構(gòu)建了Sox9過(guò)表達(dá)及干擾的肝癌細(xì)胞系,使用定量PCR及免疫印跡驗(yàn)證后,使用濃度為4μM的索拉菲尼進(jìn)行體外培養(yǎng),于1、3、5、7天使用CCK-8試劑進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。此外,取培養(yǎng)48小時(shí)后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力,同時(shí)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡狀況檢測(cè)。結(jié)果:1、在使用含有索拉菲尼的培養(yǎng)液培養(yǎng)后,過(guò)表達(dá)Sox9的肝癌細(xì)胞活力高于對(duì)照組,而干擾Sox9表達(dá)的肝癌細(xì)胞活力低于對(duì)照組。2、過(guò)表達(dá)Sox9的肝癌細(xì)胞在使用4μM索拉菲尼培養(yǎng)48h后,其克隆形成能力高于對(duì)照組,其凋亡水平低于對(duì)照組,而干擾Sox9的肝癌細(xì)胞的克隆形成能力低于對(duì)照組,凋亡水平高于對(duì)照組。在已構(gòu)建的過(guò)表達(dá)及敲減細(xì)胞系中使用慢病毒轉(zhuǎn)染入luciferase,驗(yàn)證發(fā)光效率后使用Sox9過(guò)表達(dá),Sox9干擾以及對(duì)照空病毒細(xì)胞構(gòu)建裸鼠的皮下荷瘤及尾靜脈注射模型,建模后每72小時(shí)按20mg/kg體重給予索拉菲尼灌胃處理。與不同觀察節(jié)點(diǎn)(0w,1w,3w,5w,7w)記錄裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)值,并于7w后取出皮下荷瘤的瘤體,計(jì)量體積并稱重,分析不同處理組的腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。結(jié)果:1、過(guò)表達(dá)Sox9組的裸鼠其皮下腫瘤的熒光值高于對(duì)照組,7w后其腫瘤重量高于對(duì)照組,而干擾Sox9的裸鼠其體內(nèi)腫瘤熒光值低于對(duì)照組,7w后腫瘤重量低于對(duì)照組。2、在肺轉(zhuǎn)移模型中,過(guò)表達(dá)Sox9組的裸鼠肺內(nèi)腫瘤熒光值高于對(duì)照組,而干擾Sox9組的裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)值低于對(duì)照組。第三部分Sox9通過(guò)Akt通路影響肝細(xì)胞癌對(duì)索拉菲尼耐藥性使用Sox9干擾的7721細(xì)胞系,以空病毒7721細(xì)胞系為對(duì)照進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片的檢測(cè),檢測(cè)不同基因的表達(dá)情況。并使用Pathway分析觀察基因在信號(hào)通路的富集清情況。之后使用免疫印跡驗(yàn)證差異基因的表達(dá)。結(jié)果:1、表達(dá)譜芯片顯示在Sox9干擾的細(xì)胞系中,下調(diào)的基因在TGF-β,m TOR,VEGF等通路的存在富集現(xiàn)象,其中與腫瘤耐藥密切相關(guān)的Akt通路亦存在下調(diào)基因的富集,此外作為Akt下游的耐藥基因,BCRP亦存在顯著下調(diào)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,HCC可以通過(guò)Oct4-Akt-BCRP產(chǎn)生對(duì)化療藥物的耐藥性。之后我們使用免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Akt/BCRP通路在Sox9過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系中上調(diào),而在Sox9干擾細(xì)胞系中下調(diào)。2、免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在使用4μM索拉菲尼處理72小時(shí)后的肝癌細(xì)胞系中,其Sox9及BCRP的表達(dá)均顯著上升。第四部分Sox9通過(guò)Akt/BCRP影響HCC對(duì)于索拉菲尼的耐藥性使用相應(yīng)的慢病毒構(gòu)建Sox9+/BCRP+/Sox9+BCRP-/NC的細(xì)胞系,使用4μM索拉菲尼體外培養(yǎng)后進(jìn)行Brdu,克隆形成及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。使用帶有Luciferase的7721細(xì)胞感染相應(yīng)慢病毒從而構(gòu)建上述四種細(xì)胞系,使用這些細(xì)胞系構(gòu)建裸鼠的腫瘤細(xì)胞脾注射肝轉(zhuǎn)移模型,之后每72h給予索拉菲尼灌胃,使用活體成像儀記錄腫瘤熒光信號(hào)。結(jié)果顯示:1.在使用索拉菲尼后,Sox9+及BCRP+細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力較對(duì)照組高,而凋亡及壞死細(xì)胞的比例較對(duì)照組低,而Sox9+BCRP-細(xì)胞增殖能力及克隆形成能力較對(duì)照組減弱,凋亡及壞死的細(xì)胞比例較對(duì)照組高。2.Sox9+及/BCRP+的細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)的熒光值高于對(duì)照組,而Sox9+BCRP-的細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的熒光值低于對(duì)照組。結(jié)論根據(jù)上述結(jié)果,結(jié)合四部分內(nèi)容,可以總結(jié)得到:1、肝細(xì)胞癌細(xì)胞系在使用索拉菲尼后,其Sox9的表達(dá)在m RNA水平或者蛋白水平均逐漸升高,且HCC細(xì)胞系中Sox9陽(yáng)性的細(xì)胞比例增高,由此可以推測(cè)Sox9升高有助于肝細(xì)胞癌提高對(duì)索拉菲尼的耐藥性,從而抵抗索拉菲尼對(duì)于其的殺傷作用。2、過(guò)表達(dá)Sox9的肝癌細(xì)胞系在索拉菲尼的壓力下,較對(duì)照組細(xì)胞活力高,增殖能力強(qiáng),細(xì)胞凋亡比例低。在皮下荷瘤及尾靜脈注射轉(zhuǎn)移的裸鼠模型中,Sox9過(guò)表達(dá)組的腫瘤在活體成像儀中的信號(hào)值更強(qiáng),而干擾Sox9表達(dá)的肝癌細(xì)胞系則相反。由此可從另一面驗(yàn)證Sox9升高能夠提升肝細(xì)胞癌對(duì)索拉菲尼的耐藥性。3、干擾Sox9的表達(dá)譜芯片提示Sox9可影響Akt/BCRP通路的表達(dá),而Akt通路與索拉菲尼耐藥密切相關(guān),所以Sox9可能通過(guò)調(diào)控Akt/BCRP通路影響肝細(xì)胞癌對(duì)于索拉菲尼的耐藥性。之后的拯救實(shí)驗(yàn)顯示在過(guò)表達(dá)Sox9的肝癌細(xì)胞系中干擾BCRP的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)Sox9過(guò)表達(dá)所帶來(lái)的索拉菲尼耐藥性,由此驗(yàn)證了表達(dá)譜芯片中的結(jié)論
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1923398