本文選題：多形性膠質母細胞瘤　切入點：miR-874　出處：《天津醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：研究目的和內容:多形性膠質母細胞瘤是一種常見的高度惡性的顱內原發(fā)性腫瘤。目前,臨床對于惡性膠質瘤的治療主要是手術結合放療、化療及其他綜合治療。多形性膠質母細胞瘤呈浸潤性生長,手術很難完全切除,術后易復發(fā),且對化療和放療往往具有抗性,因而其預后很差,病人的平均生存期一般不超過兩年。替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是一種DNA烷化劑,可使O6-甲基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(一種DNA修復蛋白)失活。O6-甲基鳥嘌呤在下一個DNA復制循環(huán)中無法配對正確的堿基對,子鏈DNA形成缺口,最終導致細胞凋亡。研究表明,替莫唑胺能夠顯著改善膠質瘤患者的預后,已成為膠質瘤化療的一線藥物。但是由于膠質瘤存在于顱內,藥物需要穿透血腦屏障,以及現在抗癌藥物的耐藥性等不利因素,膠質瘤的治療及預后并不是很理想。所以,進一步探討膠質瘤的發(fā)病機制,找尋新的增強腫瘤化療敏感性的方法,是十分迫切的。Micro RNAs是一類長度約為21-23個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,它們在膠質瘤的癌變及發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調控作用。其主要是通過與靶基因的3’端非轉錄區(qū)域(3‘UTR)特異性結合。人類超過1/3的基因都可以被mi RNAs所靶定,這些mi RNAs在細胞凋亡、增殖、分化、生長和代謝中發(fā)揮著重要作用。Micro RNA-874(mi R-874)參與了人類許多的腫瘤調控過程。本課題組的前期實驗研究也發(fā)現在人類膠質瘤細胞中mi R-874表達量降低,并且在體外膠質瘤細胞中過表達mi R-874能夠抑制膠質瘤細胞的增殖并且促進凋亡。但是,調控mi R-874在膠質瘤內的表達是否能夠促進膠質瘤的化療增敏性,我們還不是很清楚。所以,在本實驗中,我們著重研究上調mi R-874的表達,對于替莫唑胺(TMZ)在多形性膠質母細胞瘤化療治療中敏感性的影響,并從分子水平探討其作用的機制。方法:1.細胞轉染及轉染效率的檢測:首先培養(yǎng)膠質瘤細胞株U87和LN229,采用瞬時轉染技術,利用lipofectamine 2000將mi R-874模擬體(mimics)轉染至兩種膠質瘤細胞內。用lipofectamine 2000將陰性對照序列scramble轉染至兩種膠質瘤細胞內。2.實驗分組及藥物處理:分為scramble,TMZ,mi R-874,mi R-874+TMZ治療組。上調膠質瘤細胞中mi R-874的表達,6小時后更換新鮮完全培養(yǎng)基,同時給予不同劑量替莫唑胺進行作用,化療24小時、48小時。3.利用MTT方法檢測細胞增殖,Annexin V/PI流式染色檢測細胞凋亡,JC-1流式染色檢測線粒體膜電位變化情況,Transwell實驗檢測細胞的侵襲、遷移情況,Western blotting檢測細胞STAT3、凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax以及遷移侵襲相關蛋白MMPs的表達情況。結果:1.轉染mi R-874 mimics上調膠質瘤細胞中mi R-874的表達,給予替莫唑胺治療24、48小時后,MTT結果顯示相對于對照組,mi R-874聯(lián)合TMZ治療能夠明顯抑制膠質瘤細胞U87和LN229的增殖活性,差異顯著具有統(tǒng)計學意義(P0.05);2.Annexin V/PI及線粒體膜電位流式分析發(fā)現,相對于其他三組(scramble,TMZ,mi R-874),mi R-874聯(lián)合TMZ治療組的膠質瘤細胞凋亡最為明顯,差異顯著具有統(tǒng)計學意義(P0.05);3.通過Transwell實驗我們發(fā)現mi R-874聯(lián)合TMZ組的膠質瘤細胞的遷移、侵襲能力明顯受到抑制,與對照組差異顯著具有統(tǒng)計學意義(P0.05);4.Western Blotting結果顯示,mi R-874聯(lián)合TMZ組的p-STAT3/STAT3信號通路受到抑制,抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低,促凋亡蛋白Bax表達水平上調,遷移侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9的表達水平降低,差異顯著具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:MTT發(fā)現轉染mi R-874能夠明顯增強TMZ抑制膠質瘤細胞生長活性的能力;Annexin V/PI及線粒體膜電位流式分析發(fā)現,mi R-874聯(lián)合TMZ治療可以顯著增強替莫唑胺對惡性膠質瘤細胞的凋亡誘導作用,其機制可能與p-STAT3/STAT3信號通路受到明顯抑制,Bcl-2表達降低,Bax表達上調,MMP-2、MMP-9表達降低有關;Transwell實驗發(fā)現轉染mi R-874能明顯抑制膠質瘤細胞的遷移、侵襲能力。這些提示:惡性膠質瘤細胞中mi R-874過表達,通過調控p-STAT3/STAT3通路增強膠質瘤細胞對TMZ的化療敏感性,兩者在惡性膠質瘤化療中有協(xié)同作用。通過闡明mi R-874在膠質瘤細胞化療中的作用及其機制有助于對惡性腫瘤的耐藥進一步深入的了解,同時也為腫瘤化療治療提供新的線索。
[Abstract]:The research purpose and content: glioblastoma multiforme is a common malignant primary intracranial tumor. At present, the clinical treatment for malignant glioma is mainly surgery combined with radiotherapy, chemotherapy and other comprehensive treatment. Glioblastoma multiforme infiltrative growth, it is difficult to completely surgical resection, surgery after recurrence, and often with resistance to chemotherapy and radiotherapy, the prognosis is very poor, the average survival time of patients is generally not more than two years. Temozolomide (Temozolomide, TMZ) is a DNA alkylating agent, can make O6- methylguanine -DNA alkyl transferase (a DNA repair protein) inactivation of.O6- methylguanine in the next DNA copy the correct base pair not matching cycle, DNA sub chain form a gap, eventually lead to apoptosis. The results show that temozolomide could significantly improve the prognosis of patients with glioma, glioma chemotherapy has become a Line drugs. But due to intracranial glioma in medicine, need to penetrate the blood-brain barrier and anticancer drug resistance now and other unfavorable factors, treatment and prognosis of glioma is not very satisfactory. Therefore, to further explore the pathogenesis of glioma, the method to find the tumor chemotherapy sensitivity enhancement, is very urgent.Micro RNAs is a kind of non encoding single stranded RNA molecules of about 21-23 nucleotides in length, they play an important role in the process of carcinogenesis and development of glioma. It is mainly through the target gene 3 'untranslated regions (3' UTR) specific binding to human 1/3 gene over mi RNAs can be targeted, these mi RNAs in apoptosis, proliferation, differentiation, and plays an important role in the growth and metabolism of.Micro RNA-874 (MI R-874) is involved in many human tumor regulation process. This lesson early problem sets The study also found that the decrease of MI R-874 expression in human glioma cells and glioma cells in vitro, overexpression of MI in R-874 can inhibit the proliferation of glioma cells and promote apoptosis. However, whether the regulation of MI expression in R-874 glioma can promote glioma chemotherapy sensitization, we are not very sure. So, in this paper, we mainly study the upregulation of MI R-874 expression, for temozolomide (TMZ) sensitivity in glioblastoma chemotherapy, and to explore its mechanism at molecular level. Methods: to detect 1. cell transfection and transfection efficiency: first training U87 and the LN229 glioma cell line by transfection technique, using Lipofectamine 2000 mi R-874 model (mimics) was transfected into two glioma cells by Lipofectamine 2000. The negative control sequence were transfected by scramble two Glioma cell.2. in experimental groups and drug treatment: scramble, TMZ, MI, R-874, MI, R-874+TMZ group. Expression of glioma cells in MI R-874, 6 hours after the replacement of fresh complete medium, and given different doses of temozolomide chemotherapy effect, 24 hours, 48 hours by.3. MTT cell proliferation detection method, Annexin V/PI flow cytometry staining to detect cell apoptosis, JC-1 flow cytometry staining was used to detect the changes of mitochondrial membrane potential, Transwell assay, cell invasion, migration, Western blotting detection of cell STAT3, apoptosis related protein Bcl-2, Bax expression and invasion related protein MMPs. Results: the expression of 1. gene mi R-874 mimics mi R-874 up-regulated in glioma cells, given temozolomide therapy after 24,48 hours, MTT results showed that compared with the control group, MI R-874 combined with TMZ therapy can significantly inhibit glioma cells U87 and LN229 proliferation activity, with significant difference (P0.05); V/PI and mitochondrial membrane potential of 2.Annexin flow cytometry analysis showed that compared with other three groups (scramble, TMZ, MI, R-874) apoptosis of glioma cells combined with TMZ treatment group mi R-874 was the most obvious, significant difference was statistically significant (P0.05) 3.; through the Transwell experiment we found that the migration of MI R-874 combined with TMZ group of glioma cells, the invasion ability was significantly inhibited, and the control group with significant difference (P0.05); 4.Western Blotting showed that p-STAT3/STAT3 signaling pathway mi R-874 combined with TMZ group was inhibited, the anti apoptotic protein Bcl-2 expression level decreased, apoptosis Bax protein expression level increased, the migration and invasion related protein MMP-2, MMP-9 expression level was decreased, the difference was statistically significant (P0.05). Conclusion: MTT R-874 can increase the transfection of MI found Strong ability to inhibit the growth of glioma cells TMZ activity; V/PI and mitochondrial membrane potential of Annexin flow cytometry analysis showed that MI R-874 combined with TMZ therapy can significantly enhance temozolomide on apoptosis of malignant glioma cells induced by hypoxia and its mechanism may be related to p-STAT3/STAT3 signaling pathway was inhibited, Bcl-2 expression decreased, increased expression of Bax MMP-2 the expression of MMP-9, decrease; Transwell experiments indicated that transfection of MI R-874 could significantly inhibit the migration of glioma cells invasion. These suggest that over expression of malignant glioma cells mi R-874 enhances chemosensitivity of glioma cells to TMZ by regulation of p-STAT3 /STAT3 pathway, both have synergistic effect in chemotherapy of malignant glioma through. Clarify mi R-874 in glioma cells in the chemotherapy effect and mechanism contributes to the resistance of malignant tumor and further in-depth understanding, but also for the treatment of cancer chemotherapy The therapy provides a new clue.

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.4

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