本文選題：CDC25B基因　切入點：miRNA-16　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:檢測CDC25B在多發(fā)性骨髓瘤中的表達;構(gòu)建sh RNA-CDC25B慢病毒表達載體,沉默骨髓瘤細胞株CDC25B基因的表達,探究CDC25B基因沉默后對骨髓瘤細胞生物學(xué)特性的影響;利用生物信息學(xué)反向預(yù)測調(diào)控CDC25B的mi RNA,構(gòu)建該mi RNA高表達的慢病毒載體以靶向抑制CDC25B基因的表達,由此通過穩(wěn)定干擾CDC25B基因的骨髓瘤細胞株觀察mi RNA抑制CDC25B基因后對骨髓瘤細胞的生物學(xué)效應(yīng);研究全反式維甲酸對多發(fā)性骨髓瘤細胞的生物學(xué)效應(yīng)及其作用其機制。方法:(1)利用基因芯片和Western Blot檢測CDC25B在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達。(2)利用real-time PCR和western blot檢測CDC25B在骨髓瘤細胞株RPMI8226和U266中的表達。設(shè)計合成以CDC25B為靶標(biāo)的sh RNA,構(gòu)建慢病毒表達載體—GV248-sh RNA,并以空載體做對照。由上海吉凱公司包裝出高滴度的慢病毒顆粒,感染CDC25B表達明顯上調(diào)的骨髓瘤細胞株,經(jīng)流式細胞儀分選獲得穩(wěn)定株;利用CCK8檢測sh RNA干擾CDC25B后骨髓瘤細胞增殖、流式細胞術(shù)(FCM)檢測干擾后骨髓瘤細胞周期和凋亡的變化、Hoechst 33258熒光染色法觀察干擾后細胞凋亡的形態(tài)變化。(3)利用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測mi R-16對CDC25B表達的影響。(4)利用real-time PCR檢測mi R-16在骨髓瘤細胞株RPMI8226和U266中的表達;設(shè)計合成mi R-16序列,構(gòu)建慢病毒表達載體—GV217-mi R-16,以空載體做對照,由上海吉凱公司包裝出高滴度慢病毒顆粒,感染mi R-16表達明顯下調(diào)的骨髓瘤細胞株,再經(jīng)流式細胞儀分選獲得穩(wěn)定細胞株;real-time PCR檢測mi R-16及CDC25B m RNA表達,Western blot檢測CDC25B蛋白表達,CCK8檢測過表達mi R-16的骨髓瘤細胞增殖,FCM檢測過表達mi R-16骨髓瘤細胞周期和凋亡的變化。(5)不同濃度全反式維甲酸(ATRA)作用于骨髓瘤細胞后,應(yīng)用CCK8檢測細胞增殖變化,采用48小時50%抑制率的藥物濃度(IC50)作用于骨髓瘤細胞,FCM檢測48小時后骨髓瘤細胞周期和凋亡的變化,real-time PCR、western blot檢測ATRA作用后骨髓瘤細胞mi R16和CDC25B表達情況。結(jié)果:(1)收集臨床確診的初治多發(fā)性骨髓瘤患者和正常供者的骨髓標(biāo)本,基因芯片和Western blot檢測顯示,多發(fā)性骨髓瘤患者CDC25B明顯高表達。(2)real-time PCR和western blot結(jié)果顯示,CDC25B m RNA和蛋白水平表達在骨髓瘤細胞RPMI8226中明顯高于U266;real-time PCR結(jié)果顯示mi R-16在骨髓瘤細胞RPMI8226中表達明顯低于U266。由此,我們選用RPMI8226作為細胞模型進行后續(xù)實驗。(3)成功構(gòu)建、包裝高表達GA248-sh RNA-CDC25B的慢病毒,感染骨髓瘤細胞RPMI8226并建立穩(wěn)定細胞株;real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示干擾組細胞CDC25B m RNA和蛋白水平表達均明顯下調(diào),sh RNACDC25B干擾成功。(4)CDC25B基因沉默后對骨髓瘤細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響:①CCK8結(jié)果顯示:與空載對照組相比,基因沉默后RPMI8226細胞增殖受抑,24~96小時抑制率為25.41~28.22%;②FCM檢測細胞周期顯示:RPMI8226對照組和干擾組G2/M期細胞比例分別為9.21±0.09%和32.60±2.93%(P0.05);③FCM檢測細胞凋亡顯示:RPMI8226對照組和干擾組細胞凋亡率分別為:17.28%和35.31%。(5)熒光素酶報告系統(tǒng)檢測高表達mi R-16對CDC25B的影響:mi R-16靶向CDC25B 3’UTR。(6)成功構(gòu)建并包裝高表達mi R-16慢病毒,感染骨髓瘤細胞RPMI8226并建立穩(wěn)定細胞株。real-time PCR結(jié)果顯示:高表達mi R-16組細胞mi R-16表達上調(diào)約1448.15倍,過表達mi R-16成功;real-time PCR和western blot結(jié)果顯示:CDC25B在m RNA和蛋白水平表達均下調(diào),mi R-16靶向抑制CDC25B成功。(7)mi R-16靶向抑制CDC25B后對骨髓瘤細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響:①CCK8顯示:與對照組相比,RPMI8226干擾組細胞增殖受抑,24~72小時增殖抑制率為18.78~30.74%;②FCM檢測細胞周期結(jié)果顯示:RPMI8226對照組和干擾組G2/M期細胞比例分別為15.00±3.14%和29.90±3.60%(P0.05);③FCM檢測細胞凋亡結(jié)果顯示:RPMI8226細胞對照組和干擾組凋亡率分別為:17.10%和32.84%。(8)ATRA對RPMI8226細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響:①不同濃度(0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)ATRA作用于RPMI8226后24~96小時,骨髓瘤細胞增殖抑制率分別為7.17~37.95%、8.42~54.09%、14.38~66.65%、17.01~74.46%、20.04~83.12%、26.20~88.52%,48小時IC50約為3μmol/L;②3μmol/L ATRA作用于RPMI8226 48小時,FCM檢測細胞周期顯示:對照組和ATRA組G2/M期細胞比率分別為9.67±0.94%和18.91±1.77%(P0.05);FCM檢測細胞凋亡顯示:對照組和ATRA組凋亡率分別為18.66%和33.46%。(9)3μmol/L ATRA作用于RPMI8226 48小時后,real-time PCR顯示:mi R-16表達上調(diào),CDC25B m RNA表達下調(diào);Western blot顯示:CDC25B蛋白水平表達明顯下調(diào)。結(jié)論:(1)在多發(fā)性骨髓瘤中高表達的CDC25B有可能成為骨髓瘤治療的新基因靶標(biāo);(2)CDC25B沉默后RPMI8226骨髓瘤細胞株表現(xiàn)為細胞增殖受抑,促進凋亡,細胞周期阻滯于G2/M期;(3)mi R-16靶向抑制CDC25B后可抑制骨髓瘤細胞增殖,促進凋亡,細胞周期阻滯于G2/M期;(4)維甲酸可能通過上調(diào)mi R-16,從而抑制CDC25B表達而影響骨髓瘤細胞的生物學(xué)行為。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71

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本文編號：1705330