本文選題：p66Shc　切入點：結直腸癌　出處：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景及目的結腸癌是一種人類高發(fā)的惡性腫瘤,在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位居第三位,其死亡率居惡性腫瘤死因的第二位,是男性罹患的第四大惡性腫瘤,女性所患惡性腫瘤中結直腸癌居第三位,2014年國際癌癥研究機構在全球范圍內涉及184個國家的多種常見惡性腫瘤的調查結果顯示,美國2014年結直腸癌新增病例約96,830例,死亡人數39,590例,由此可見目前發(fā)達國家的結直腸癌的治療效果亦不盡如人意,在我國結直腸癌是威脅人民健康的第五大惡性腫瘤,近10余年,我國的結腸癌發(fā)病率、死亡率一直呈上升趨勢,患者的5年生存率也徘徊不前。目前,早期結直腸癌患者可以通過根治性手術得到治療,并獲得較好的預后,但是由于非侵入性檢查對于空腔臟器的不敏感性以及結腸鏡無癥狀篩查理念的未被普及等因素的影響下,大多結直腸癌患者被檢出時病變已經發(fā)展至中晚期,目前對于中晚期結直腸癌的臨床治療技術仍不完善,因此,開發(fā)研究進展期結直腸癌的治療方法,干預結直腸癌進一步發(fā)展,提高晚期結直腸癌患者的生存率,延長其生存期勢在必行,是結直腸癌治療領域的重點。迄今為止,研究報道提示SHC家族共有四個基因成員構成,分別是ShcA, ShcB, ShcC, ShcD。其中,在哺乳動物的ShcA蛋白家族編碼三個主要成員,分別是p46Shc, p52Shc, p66Shc,三個亞單位接受不同的細胞信號的調控,執(zhí)行不同的生理功能,三者均有高度保守的C端區(qū)域,都有磷酸酪氨酸結合區(qū)(PTB),富含脯氨酸的同源結構域(CH1) ,Src同源結構域(SH2),除卻上述三個相同的結構特點外,p66Shc還有不同于其它兩者的獨有結構,其所特有的結構是N端脯氨酸富集區(qū)CH2,該區(qū)域包含細胞色素C的結合域,在36位含有磷酸絲氨酸位點,該位點是一個潛在的磷酸化位點,已有研究表明,3種蛋白(p46Shc, p52Shc, p66Shc)均具有調節(jié)酪氨酸激酶受體信號傳導通路的作用,該功能極有可能在促進細胞有絲分裂及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中承擔重要作用,而p66Shc因其獨特的CH2區(qū)域,因此具有更為獨特的功能。已有的研究證實p66Shc主要存在于胞質中,小部分定位于線粒體,p66Shc在多種惡性腫瘤細胞中均呈高表達狀態(tài),如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等。在腫瘤與信號通路的研究提示,p66Shc適配蛋白參與多條信號通路,諸如激活Ras有絲分裂信號通路,參與磷脂酰肌醇3-激酶/蘇氨酸激酶(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路等。在過去的20年里,對Shc蛋白家族的亞型、結構、信號通路、致癌分子機制等生理功能的研究取得了重大進展,但仍有許多問題尚待解決。眾所周知,PI3K/Akt通路是一條被廣泛認可的重要的信號通路,在此信號通路中的PI3K,其屬于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)家族,是該家族中研究最廣泛的一個成員。在哺乳動物細胞中,PI3K參與多種細胞內生物過程,如細胞周期進程、細胞生長、運動、粘附及存活,其與下游的調控分子Akt蛋白共同構成PI3K/Akt信號通路,該條通路與人類惡性腫瘤密切相關,在該信號通路中任何參與調控信號傳導的蛋白質發(fā)生異常都可能會導致細胞惡性轉化,同時研究發(fā)現(xiàn),上述過程的失控與腫瘤細胞的遠處轉移、微環(huán)境黏附、腫瘤血管生成以及細胞外基質的降解等密切相關。與所有的信號傳導通路相同的是,PI3K /Akt信號通路接受到信號后,PI3K被激活,活化后的PI3K首先在細胞膜上產生第二信使PIP3,然后PIP3與細胞內的下游信號蛋白Akt和磷酸化依賴型蛋白激酶1(PDK1)結合,之后Akt蛋白的S308發(fā)生磷酸化最終引起Akt的活化,活化的Akt可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase-9等效應蛋白,進而發(fā)揮調節(jié)細胞的生理過程的作用。Akt也能通過直接磷酸化促凋亡蛋白Bad來促進細胞的生存。Bad是Bcl-2家族中的一個促凋亡蛋白,它通過結合和拮抗Bcl-2來促進細胞凋亡(Apoptosis)。Akt能直接使Bad與胞質中的蛋白螯合,從而終止Bad在線粒體膜上對Bcl-2的拮抗作用,使得被釋放后的Bcl-2,恢復抗細胞凋亡的功能。最近的研究提示,Akt通路通過Mdm-2-p53功能通路參與細胞周期的調節(jié),眾所周知,p53是經典的抑癌基因,然而當Mdm-2以單體形式進入細胞核后可與p53結合,促進其降解,因此Mdm-2可以抑制p53的功能,從而進一步影響細胞周期的進行,然而Mdm-2是Akt的下游作用底物,因此推測PI3K/Akt/Mdm-2/p53通路是一條調節(jié)細胞周期的重要通路。眾多的研究表明,PI3K/Akt通路在多種惡性腫瘤組織中被激活及過表達,諸如胃癌、乳腺癌、胰腺癌等,PI3K/Akt通路能夠抑制許多腫瘤抑制蛋白的表達,諸如Bad, FOXO轉錄因子等,Akt可以通過磷酸化作用活化Bad,活化后的Bad與Bcl-2解離,從而使Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用,因此,阻斷PI3K/Akt通路可能對于抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡有重要意義。在關于乳腺癌、前列腺癌的研究中表明,p66Shc參與了細胞的線粒體介導的細胞凋亡過程,多數報道認為p66Shc通過氧化應激過程參與了腫瘤細胞抗凋亡過程,在我們的前期實驗中表明,p66Shc有促進結直腸癌細胞增殖及抗凋亡作用,而且預實驗結果提示p66Shc的表達水平與Bcl-2蛋白家族、蛋白水解酶存在相關關系,因此提出假說考慮p66Shc的通過PI3K/ Akt/Mdm-2/p53通路參與調控結直腸癌的增殖和凋亡過程。在我們的實驗研究中,首先檢測驗證了p66Shc在結直腸癌組織及結直腸細胞株中的表達水平,其次通過干擾其表達進一步研究p66Shc沉默后對結直腸癌細胞的增殖、凋亡的影響,最后檢測PI3K/Akt/Mdm-2/p53通路中的凋亡相關蛋白的表達變化,旨在探討p66Shc對結直腸癌細胞增殖、凋亡的影響及信號調控通路的調控機制,為臨床干預進展期結直腸癌的增殖、凋亡提供理論實驗基礎。研究方法1. p66Shc在結直腸癌組織及細胞株中的表達采用實時定量PCR技術(RT-PCR)與免疫印跡(Western blot)技術檢測30例結直腸癌組織和癌旁組織中p66Shc的表達。檢測細胞株(NCM460. HCT8、HCT116、SW620、CaC02)中p66Shc的表達水平。(NCM460是正常結腸上皮細胞,其余四株是結直腸癌細胞)。2.干擾結腸癌細胞株HCT8中的p66Shc的表達(1)利用生物信息在線網站Ambion、Genesil、Genecard設計RNAi序列。(2)生物技術公司合成si-p66Shc,運用RNA干擾技術沉默HCT8中的p66Shc的表達。(3) RT-PCR、Western blot技術檢測干擾效果。3.干擾p66Shc的表達對結直腸細胞增殖、凋亡的影響(1)運用CCK-8細胞增殖實驗,檢測干擾p66Shc對HCT8細胞增殖的影響。(2)運用流式細胞技術AnnexinV-FITC方法,檢測干擾p66Shc對HCT8細胞凋亡的影響。4. p66Shc調節(jié)結直腸癌細胞信號通路的初步研究(1)干擾p66Shc對結直腸癌細胞中凋亡相關蛋白的影響運用Western blot法檢測HCT-8干擾后的細胞中細胞凋亡蛋白caspase-3、 caspase-9、Bax、Bcl-2的表達變化。(2)干擾p66Shc對PI3K-AKT信號通路相關蛋白的影響運用Western blot法檢測干擾后p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-Mdm-2、 p53表達變化。5.流式細胞儀檢測干擾p66Shc后對HCT-8細胞周期的影響6.統(tǒng)計學方法研究中所有數據均采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析。定量數值采用均數±標準差(standard deviation,SD)表示。其中組織的RT-PCR結果ACt的比較采用配對樣本t檢驗(Paired-Sample t text)。實驗過程中RT-PCR實驗結果采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)法進行統(tǒng)計分析。CCK-8體外增殖實驗采用方差分析和單因素方差分析法進行分析。所有統(tǒng)計學結果P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。研究結果1. p66Shc在結直腸癌組織和細胞中呈高表達狀態(tài)與腫瘤的增殖、生長有關(1) 實時定量PCR技術(RT-PCR)檢測結果顯示30例結直腸癌組織中p66Shc的表達高于癌旁組織(P0.05)。(2) 實時定量PCR技術(RT-PCR)、免疫印跡(Western blot)技術檢測細胞株(NCM460、HCT8、HCT116、SW620、CaCO2)中的p66Shc的表達,在結直腸癌細胞株中的p66Shc的表達高于正常結腸上皮細胞(NCM460)(P0.05),其中HCT8細胞株中p66Shc的表達最為顯著(P0.01)。2.干擾p66Shc的表達對結直腸癌細胞增殖、凋亡的影響(1) 成功干擾HCT-8細胞中p66Shc的表達后,CCK-8體外增殖實驗表明,Control組、si-scramble組、si-p66Shc組各組的細胞增殖能力有顯著差異(P0.01),si-p66Shc組在干擾后的第3-6天,細胞的增殖被顯著抑制(P0.05)。(2) 干擾HCT-8細胞中p66Shc的表達后,與si-scramble相比si-p66Shc組的活細胞數有所減少(si-scramble組97.0%,si-p66Shc組84.8%,P0.05),兩組間凋亡細胞差異顯著(si-scramble組0.112%,si-p66Shc組0.159%,P0.05),數據表明干擾p66Shc的表達促進結直腸癌細胞凋亡。3.p66Shc調節(jié)結直腸癌細胞信號通路的初步研究(1) 流式細胞儀分析干擾p66Shc對HCT8細胞周期的影響在本部分實驗中運用流式細胞儀技術檢測了干擾p66Shc后,對HCT8的細胞周期的影響,研究結果表明,干擾后的細胞較之對照組G0/G1期細胞比例明顯增加(P0.01),而G2/M期細胞比例顯著減少(P0.05),由此印證了干擾p66Shc可以使結直腸癌細胞停滯在G0/G1期。(2) Western blot法檢測p66Shc干擾后的HCT8中凋亡相關蛋白表達Western blot法檢測Control、si-scramble、si-p66Shc三組結直腸癌細胞中蛋白水解酶(Caspase-3, Caspase-9)、促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,在實驗結果中我們可以看到,當結直腸癌細胞株中的p66Shc被干擾后,Caspase-3, Caspase-9,促凋亡蛋白Bax表達水平顯著增加(P0.01),同時,觀察到抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著下降(P0.01)。(3) p66Shc干擾對PI3K-AKT信號通路相關蛋白的影響在本部分的研究中發(fā)現(xiàn),在p66Shc被干擾后,HCT8中PI3K、AKT的磷酸化作用被抑制,同時發(fā)現(xiàn)AKT的下游因子Mdm-2明顯受到抑制,然而,相反的p53的表達明顯增加。結果證實干擾p66Shc后通過PI3K/AKT/Mdm-2 /p53信號通路發(fā)揮抑制HCT8細胞的增殖的作用。結論1. p66Shc在結直腸癌組織中呈高表達,同樣在結直腸癌細胞株用亦呈高表達,初步推斷p66Shc在結直腸癌的發(fā)病過程中發(fā)揮促癌作用。2.干擾p66Shc表達可以抑制結直腸癌細胞的增殖,同時促進結直腸癌細胞的凋亡。提示通過干擾p66Shc對于控制腫瘤細胞的增殖具有重要意義。3.干擾p66Shc表達可以使結直腸癌細胞周期停滯在G1期,印證了p66Shc對于結直腸癌細胞增殖過程的作用。4.干擾p66Shc表達后HCT8中Caspase-3, Caspase-9,促凋亡蛋白Bax表達水平顯著增加,PI3K、AKT的磷酸化作用被抑制,AKT的下游因子Mdm-2表達下調,然而,p53的表達明顯增加。因此分析認為,干擾p66Shc表達后在HCT8中通過PI3K/AKT/Mdm-2/p53信號通路實現(xiàn)了細胞調控。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.3

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本文編號：1705296