本文關(guān)鍵詞： 肝細(xì)胞癌 干擾素 SLFN5 Stat3 p53　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分SLFN5在人肝癌組織中的表達情況及其臨床意義目的:Schlafen(Slfn)基因家族作為干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)亞群,參與干擾素抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等生物學(xué)功能。近年,人們逐漸認(rèn)識到SLFN5在抑制干擾素治療敏感的惡性黑色素瘤、腎細(xì)胞癌的生長及侵襲方面發(fā)揮的作用。而SLFN5在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表達情況,及其與HCC相關(guān)臨床指標(biāo)之間的關(guān)系尚不清楚,因此我們擬通過本研究對SLFN5在HCC樣本中的表達情況及其臨床意義進行評價。方法:通過Real-time PCR,免疫組織化學(xué)和western-blot等技術(shù)檢測SLFN5基因及蛋白在HCC患者肝癌組織及配對癌旁組織中的表達情況,分析90例HCC組織芯片SLFN5蛋白的表達水平與臨床指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性,進行Kaplan-Meier生存分析并對危險因素進行Cox風(fēng)險回歸,評判SLFN5與HCC預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:肝細(xì)胞癌組織中SLFN5的表達量顯著低于相應(yīng)癌旁非癌組織。考慮到每例患者肝癌組織相對癌旁肝組織SLFN5表達變化的程度不同。為了反應(yīng)這種內(nèi)在的差異,我們構(gòu)建了一個新的變量ΔSLFN5(Δslfn5=配對的癌旁肝組織slfn5蛋白表達量-肝細(xì)胞肝癌組織slfn5蛋白表達量)分析其與臨床各相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,Δslfn5與hcc的惡性生物學(xué)行為有關(guān),即隨病理分級增加,腫瘤tnm分期增加,腫瘤直徑增大,肝癌組織中slfn5下降程度增大(Δslfn5增高),(相應(yīng)的p=0.003;p=0.014;p=0.017)。cox風(fēng)險比例模型進行回歸分析,統(tǒng)計結(jié)果顯示Δslfn5≥150(p=0.031;hr:4.101;95%ci:1.135 14.815)可能是肝細(xì)胞癌患者術(shù)后生存期的獨立危險因素。結(jié)論:肝癌組織的slfn5表達均顯著低于癌旁組織,肝癌組織中slfn5下降越多,對應(yīng)越高的病理分級,更高的tnm分期和較大的腫瘤直徑。kaplan-meier生存分析表明,Δslfn5≥100或150預(yù)示較差的術(shù)后生存期。cox比例風(fēng)險回歸模型結(jié)果顯示,Δslfn5≥150是臨床不良預(yù)后的獨立危險因素(p=0.031;hr:4.101)。第二部分:slfn5對體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞增殖抑制作用及其機制研究目的:在第一部分研究中我們發(fā)現(xiàn)slfn5在人hcc組織中表達降低,且slfn5表達降低的程度與hcc惡性生物學(xué)行為(更高的病理分級、更高的tnm分期及更大的腫瘤直徑)及不良預(yù)后有關(guān)。本部分主要在體外細(xì)胞模型上,觀察slfn5表達變化對hcc細(xì)胞生長的影響并探討其可能的機制。方法:首先進一步對slfn5在體外肝癌細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞系中的表達差異進行驗證,然后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)和慢病毒載體感染方法,分別下調(diào)及上調(diào)slfn5蛋白在hcc細(xì)胞的表達,采用cck8法檢測細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、凋亡等實驗方法觀察轉(zhuǎn)染slfn5-siran及感染重組慢病毒lv5-slfn5前后細(xì)胞增殖、周期、凋亡等相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。從正反兩個方面說明slfn5蛋白對hcc細(xì)胞生長的可能影響。結(jié)果:slfn5mrna及蛋白水平的表達在正常人肝細(xì)胞l02中均明顯高于smmc-7721、huh-7、hepg2及bel7402等hcc細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光顯示slfn5在肝癌細(xì)胞中的表達定位以細(xì)胞核為主。進一步在smmc-7721及huh-7細(xì)胞干擾或過表達slfn5基因后發(fā)現(xiàn),與陰性對照組相比,干擾slfn5促進了smmc-7721細(xì)胞的增殖,而slfn5過表達后顯著地抑制了smmc-7721的增殖;但無論下調(diào)還是上調(diào)slfn5的表達,對huh-7細(xì)胞增殖無明顯的影響。干擾slfn5導(dǎo)致smmc-7721細(xì)胞周期進程加快,g1期比率減少,s期及g2/m期增加,增殖指數(shù)s+g2/m明顯增加。過表達slfn5導(dǎo)致smmc-7721細(xì)胞s期比率增高,而g2/m細(xì)胞比率減少,發(fā)生細(xì)胞周期s期阻滯。干擾或者過表達slfn5對huh-7的細(xì)胞周期進程無影響;干擾或者過表達slfn5對smmc-7721及huh-7細(xì)胞凋亡無明顯影響。wb檢測結(jié)果顯示,在smmc-7721細(xì)胞,干擾slfn5基因,可能通過上調(diào)cyclind1、cycline、cyclina和激活型cdk2(thr160)等相關(guān)細(xì)胞周期蛋白及周期蛋白依賴性蛋白激酶促進周期進程。過表達slfn5則導(dǎo)致周期蛋白及周期蛋白依賴性激酶相反的變化趨勢,進而導(dǎo)致周期阻滯。結(jié)論:與人肝癌組織ihc檢測結(jié)果一致,slfn5在正常人肝細(xì)胞中表達明顯高于hcc細(xì)胞。slfn5在肝癌細(xì)胞主要表達于肝細(xì)胞核。下調(diào)slfn5的表達可以促進細(xì)胞周期進程,促進細(xì)胞增殖。而上調(diào)slfn5表達則通過抑制細(xì)胞周期蛋白及相應(yīng)的周期蛋白依賴性激酶的表達,促使hcc發(fā)生細(xì)胞周期s期阻滯,從而抑制細(xì)胞增殖。huh-7細(xì)胞增殖、周期、凋亡均不受slfn5表達改變影響。第三部分:slfn5基因與Ⅰ型ifnα相關(guān)信號通路關(guān)系初探目的:既往學(xué)者研究小鼠slfn2基因時發(fā)現(xiàn),ifnα誘導(dǎo)slfn基因家族成員的表達不同程度依賴于stat1、stat3以及p38信號分子。但其中slfn5的誘導(dǎo)表達不僅不依賴于stat3分子,反而在stat3-/-敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)上ifnα誘導(dǎo)slfn5較stat3野生型mef細(xì)胞成倍增加。提示slfn5與stat3分子之間可能存在某種相互調(diào)控機制,而鼠的slfn5與人的slfn5是一對直系同源基因,因此,在本部分研究中我們首先證實ifnα是否也能誘導(dǎo)hcc細(xì)胞slfn5的表達;其次擬對slfn5與ifnα下游信號通路jak-stat、pi3k/akt中的關(guān)鍵信號分子stat3及akt之間可能存在的調(diào)控關(guān)系進行研究,以期對slfn5在hcc中的抗增殖作用的機制有更深入的理解。方法:本部分通過real-timepcr、免疫印跡、細(xì)胞共轉(zhuǎn)染技術(shù)與雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)分析干擾素刺激hcc細(xì)胞slfn5mrna及蛋白表達情況;slfn5表達改變對hcc細(xì)胞stat3、akt信號分子表達的影響以及對stat3轉(zhuǎn)錄活性的影響;并對調(diào)控stat3組成性激活的上游分子p53表達情況進行檢測,以探討slfn5影響stat3轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能機制。結(jié)果:ifnα刺激可誘導(dǎo)除bel-7402以外的hcc細(xì)胞和l02細(xì)胞slfn5mrna及蛋白的表達。同時發(fā)現(xiàn),hepg2與smmc-7721中p-stat3、slfn5的基線表達情況與我們推測的相符,二者之間似乎存在負(fù)向調(diào)節(jié)關(guān)系,即hepg2中p-stat3表達高于smmc-7721,slfn5則低于smmc-7721。進一步在smmc-7721細(xì)胞上干擾slfn5,結(jié)果再次印證我們的假設(shè),slfn5表達下調(diào)導(dǎo)致了p-stat3表達增加;反之,slfn5過表達則抑制了p-stat3的表達。二者對t-stat3的表達均無影響。對hcc細(xì)胞共轉(zhuǎn)染相應(yīng)的slfn5-sirna或pcmv6-slfn5-gfp及stat3的sie熒光素酶報告質(zhì)粒后stat3轉(zhuǎn)錄活性變化進行了檢測。結(jié)果進一步證實,slfn5可以負(fù)調(diào)控stat3的轉(zhuǎn)錄活性。我們發(fā)現(xiàn)slfn5可以正向調(diào)節(jié)p53野生型細(xì)胞smmc-7721的p53蛋白及其下游靶基因p21的表達;而slfn5對p53突變型細(xì)胞huh-7的p53蛋白及其下游靶基因p21無明顯調(diào)控作用。slfn5還可以抑制pi3k-akt信號通路中akt信號分子磷酸化。結(jié)論:ifnα可明顯誘導(dǎo)正常人肝細(xì)胞及hcc細(xì)胞slfn5mrna及蛋白的表達;slfn5可以負(fù)調(diào)控stat3的705位點酪氨酸殘基磷酸化,進而負(fù)調(diào)控stat3的轉(zhuǎn)錄活性,并負(fù)調(diào)控stat3下游靶基因cyclind1,抑制hcc細(xì)胞增殖。slfn5上調(diào)或下調(diào)可以影響p53野生型smmc-7721細(xì)胞的p53及下游蛋白p21的表達,而不能影響p53突變的Huh-7細(xì)胞,提示SLFN5對Stat3的磷酸化調(diào)控作用有可能是野生型p53依賴的。SLFN5也可以抑制PI3K-Akt信號通路中Akt磷酸化,提示SLFN5抗增殖作用的機制是多因素、多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1545781