本文關鍵詞： 卵巢上皮癌 化療 多藥耐藥 miRNA 卵巢上皮癌 耐藥 表達譜芯片 基因 miRNA 生物信息學 卵巢上皮癌 多藥耐藥 表達譜芯片 lncRNA ceRNA 生物信息學 卵巢上皮癌 miRNA 耐藥 miR-429 凋亡 自噬 卵巢上皮癌 miRNA 耐藥 miR　出處：《廣西醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一章miRNA與卵巢上皮癌耐藥研究進展(綜述)卵巢上皮癌是在全世界婦女中致死率第五位的最常見的婦科惡性腫瘤。手術及以紫杉醇和順鉑為主的化療是治療卵巢上皮癌重要手段之一,但多藥耐藥的產(chǎn)生又是導致化療失敗的關鍵因素。因此,了解化療耐藥產(chǎn)生的機制對于提高治療效果至關重要。卵巢上皮癌多藥耐藥與多種因素有關,本章節(jié)就miRNA與卵巢上皮癌多藥耐藥機制進行綜述。第二章miRNA對卵巢上皮癌多藥耐藥相關的生物信息學分析1.研究目的：基于表達譜芯片數(shù)據(jù)分析和生物信息學手段挖掘與卵巢癌上皮耐藥調控相關的潛在miRNAs和基因。2.研究方法：在Gene Expression Omnibus (GEO)數(shù)據(jù)庫中下載與卵巢癌耐藥相關的miRNA表達譜芯片數(shù)據(jù)GS54665和mRNA表達譜芯片數(shù)據(jù)GSE33482, GSE28646, GSE15372,并利用GEO2R工具進行差異分析和篩選,并通過實時定量PCR對其獲得的部分基因在卵巢癌順鉑耐藥細胞SKOV3/DDP和A2780/DDP及其親本細胞中進行驗證。通過通路富集、生物學過程注釋、文本挖掘、蛋白互作及miRNA-mRNA互作等綜合生物信息學方法研究差異表達miRNAs和基因與卵巢癌耐藥調控的相關性。3.研究結果：3.1在GEO數(shù)據(jù)庫獲得了符合標準的與卵巢癌耐藥相關的1組miRNA表達譜芯片數(shù)據(jù)和3組mRNA表達譜芯片數(shù)據(jù),獲得了在耐藥細胞中差異表達的9個miRNAs和在三組芯片耐藥細胞中均差異表達的38個基因,其中7個差異表達基因在三組芯片中趨勢完全一致。3.29個miRNAs的通路富集獲得了Focal adhesion、PI3K-Akt signaling pathway、ErbB signaling pathway, MAPK signaling pathway等多個與卵巢癌耐藥相關的信號通路有關,而生物學過程注釋和通路富集表明上述38個基因與細胞因子-細胞因子受體作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)通路,細胞黏附及免疫調節(jié)等卵巢癌耐藥生物學過程顯著相關3.3 miRNA-mRNA互作分析表明9個miRNAs與38個基因中的大多數(shù)成員存在靶向調控關系,從而從整體上說明本研究中篩選的差異表達miRNAs和基因與卵巢癌耐藥調控的相關性。3.4我們通過QRT-PCR對9個差異表達的miRNAs和7個差異表達基因(NHSL1, EPHA3, SNCA, USP51和ZSCAN4, EPHA7和P115)進行了表達檢測發(fā)現(xiàn),幾乎所有差異表達的miRNA在SKOV3(SKOV3/DDP)及A2780(A2780/DDP)細胞中的表達趨勢與芯片數(shù)據(jù)一致。7個差異表達的基因中,除了SNCA外,在A2780 (A2780/DDP)細胞的表達趨勢與芯片結果一致。3.5 miR-141屬于miR-200家族成員之一,EPHA7和P115為其潛在靶基因,它們在表達水平上呈負相關。4.結論：4.1通過對芯片數(shù)據(jù)分析,篩選出9個miRNA及38個mRNA與卵巢癌耐藥有關,其中7個mRNA在所有芯片結果中表達趨勢一致。4.2 EPHA7和PI15為差異表達miRNA-141的潛在靶基因,且它們在表達水平上呈負相關,可能共同參與卵巢癌耐藥,是卵巢癌靶向治療的潛在靶標第三章卵巢上皮癌多藥耐藥相關lncRNA表達譜分析及與miRNA相關的ceRNA篩選化療是晚期卵巢上皮癌的首選治療方法,但是耐藥的產(chǎn)生是妨礙化療長期有效的一個重要的因素。近年來,人們把研究的目光投向了長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, LncRNA)。長鏈非編碼RNA是一類由RNA聚合酶II轉錄形成,轉錄本長度超過200nt的RNA分子,通常具有polyA尾,廣泛分布于哺乳動物體內。由于缺少“開放閱讀框架”,lncRNA不編碼蛋白,其可在表觀遺傳學,轉錄水平和轉錄后水平等多個層面調控基因表達。但是現(xiàn)在與耐藥相關的lncRNA及與miRNA存在ceRNA調控的lncRNA還鮮有報道。1.研究目的：對卵巢癌多藥耐藥相關lncRNA和基因進行表達譜分析,初步得到卵巢癌多藥耐藥相關lncRNA及基因,為闡明卵巢癌耐藥機制和獲得具有克服耐藥潛能的靶分子打下基礎。2.研究方法：2.1.通過lncRNA芯片對卵巢癌上皮癌耐藥組織標本5例及敏感組織各5例進行l(wèi)ncRNA表達譜分析,同時分析差異表達的mRNA,找到在耐藥細胞中差異表達的lncRNA;2.2.對差異表達的lncRNA采用Pearson相關分析進行共表達基因分析、然后利用超幾何累積分布函數(shù)(Hypergeometric cumulative distribution function)按FDR0.01,P0.05,對編碼基因的進行功能注釋。2.3通過ceRNA_score原理進行ceRNA分析,并通過調控的mRNA進行GO、KEGG功能注釋；并篩選與miR-200家族相關的ceRNA。2.4通過對差異表達的lncRNAs,搜索其上下游300k范圍內的所有編碼基因,并與該lncRNAs有顯著共表達的基因取交集進行cis調控分析,按照相關系數(shù)p0.01,至少3個以上相鄰基因,篩選出lncRNA相鄰的基因。2.5根據(jù)lncRNAs共表達的編碼基因集合與轉錄因子／染色質調控復合物的靶基因集合的交集,利用超幾何分布計算該交集的富集程度,得到與lncRNAs顯著相關的轉錄因子。3.研究結果：3.1根據(jù)差異表達的標準：Fold change值≥2.0且p≤0.05,耐藥組和對敏感組相比,有738個lncRNAs表達有差異,其中上調311個,下調427個,其中NONHSAT076042 (Fold change:8.95)是上調倍數(shù)最大的lncRNA, TCONS_12_00021133 (Fold change:7.29)是下調倍數(shù)最大的lncRNA;同時檢測到有983個mRNAs表達有差異,其中上調678個,下調308個,其中SFRP2 (Fold change:28.48)是上調倍數(shù)最大的mRNA, LDLRAD1 (Foldchange:16.44)是下調倍數(shù)最大的mRNA。3.2采用Pearson相關分析,按照LncRNAs與mRNAs表達值的相關系數(shù)(Correlation)0.7, p0.05對差異表達lncRNA進行共表達基因分析,選出上調、下調lncRNA各top300,然后分別進行功能富集,篩選出預測到的功能terms top500,結果顯示上調表達的lncRNA主要與白細胞遷移、細胞外基質、DNA包裝、細胞黏附通路、ECM-受體通路等有關(p0.05)；下調表達的lncRNA主要細胞外基質組成、細胞骨架、DNA包裝、細胞黏附通路、ECM-受體通路等有關(p0.05)。3.3通過ceRNA分析,得到25個可以作為ceRNA的lncRNA,一共是335個ceRNA關系對,其中,我們也發(fā)現(xiàn)有5個lncRNA可以作為miR-200家族相關的ceRNA,形成ceRNA調控關系對13個。參與ceRNA調控的lncRNA主要參與的生物學過程及KEGG通路有：細胞黏附、NF-kappaB負調控、間質細胞的增殖、凋亡、Ras信號通路、ErbB信號通路等。3.4 cis調控分析顯示有64個lncRNA的相鄰基與其共表達基因存在交集。3.5通過trans分析,識別lncRNAs的靶基因以及輔助其進行靶基因轉錄調控的轉錄因子,篩選出E2F4、CTCF等29個轉錄因子構成lncRNAs-TF-targets調控網(wǎng)絡。在這個調控網(wǎng)絡中,所述的靶基因與lncRNA顯著共表達,而且是轉錄因子的靶基因。4結論：4.1.通過分析卵巢上皮癌耐藥組織和敏感的lncRNA和mRNA表達譜特征我們獲得了大量差異表達的lncRNA及mRNA,為我們進行卵巢上皮癌多藥耐藥機制研究提供了很好的資源4.2.與卵巢上皮癌耐藥有關的lncRNA可能是通過cis調控相鄰的基因、trans調控的轉錄因子作用于靶基因,或通過ceRNA調控miRNA,或者通過參與和調控多種信號通路和生物學過程參與卵巢上皮癌耐藥。4.35個lncRNA (NONHSAT059750、NONHSAT129265、 NONHSAT128169、ENST00000529924、TCONS_12_00003421)與miR.-429及其靶基因構成ceRNA調控網(wǎng)絡。第四章miR-429對卵巢上皮性癌SKOV3/DDP細胞的生物學功能的體外研究1.研究目的：卵巢上皮癌是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤,耐藥的產(chǎn)生是腫瘤治療過程中最嚴重的問題之一。腫瘤耐藥與多種因素有關,miRNA可能與耐藥密切相關。miR-429屬于miR-200家族,miR-200家族與多種腫瘤耐藥有關。本章我們將通過體外實驗驗證miR-429對卵巢癌SKOV3/DDP細胞生物學功能的影響。2.研究方法：我們利用慢病毒表達載體成功構建穩(wěn)定上調miR-429的EOC細胞模型,QRT-PCR檢測miR-429的表達水平,CCK8法檢測IC50、生長曲線和平板集落形成實驗檢測細胞增殖能力、流式細胞術檢測細胞凋亡,采用WB檢測miR-429對自噬相關蛋白的影響。3.研究結果：3.1與親本細胞SKOV3相比,miR-429在耐藥細胞SKOV3/DDP中下調表達,卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP對化療藥物順鉑的IC50約為親本細胞的2.5倍。3.2在SKOV3/DDP中轉染了LV-miR-429過表達病毒,miR-429的表達量較SKOV3/DDP及LV-miR-NC組,明顯升高(P0.05)。過表達miR-429后,SKOV3/DDP對順鉑的IC50明顯下降(P0.05)。3.3 CCK8增殖結果：轉染了miR-429的SKOV3/DDP細胞組的生長速度從第48h開始較miR-NC組、空白對照組的細胞降低,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)；轉染了miR-429的SKOV3/DDP細胞,克隆形成能力明顯下降(P0.05)。3.4 FCM檢測細胞凋亡實驗結果：miR-429組SKOV3/DDP細胞的凋亡率較另兩組細胞明顯升高(P0.05)；3.5在SKOV3/DDP中轉染了LV-miR-429過表達病毒后,Atg-7及LC3A/B的表達量明顯下降。4結論：4.1 miR-429可以促進卵巢癌耐藥細胞對順鉑的敏感性,抑制細胞增殖、促進凋亡；4.2過表達miR-429可能可以通過抑制自噬通路而增加卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。第五章miR-429的靶基因驗證及雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證靶基因ZEB1(NM_030751)結合位點1.研究目的：卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer, EOC),女性生殖系統(tǒng)常見的腫瘤之一,病死率高居婦科惡性腫瘤之首,晚期患者的5年生存率僅約30%。目前,雖然約80%的晚期患者初期治療有效,但大部分患者最終會出現(xiàn)化療耐藥導致疾病復發(fā)。大量研究表明miRNAs可以通過調控靶基因的表達參與信號通路,形成一個復雜而又龐大的調控網(wǎng)絡,從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及參與腫瘤耐藥的產(chǎn)生。前期研究結果表明,上調miR-429的表達可以促進SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性,本章對miR-429的靶基因及其結合位點進行驗證。2.研究方法：本研究通過miR-429的過表達病毒及miR-Negative Control(miR-NC),來轉染卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP將SKOV3/DDP細胞分為miR-429組、miR-NC組及空白對照組,用生物信息學技術如miRBase、TargetScan等數(shù)據(jù)庫預測其作用靶點,再通過Western Blot技術檢測轉染后細胞的靶蛋白的表達量來驗證miR-429的靶基因。最后通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證ZEB1上存在miR-429的作用靶點。3.研究結果：3.1 miR-429的作用靶點的預測及驗證：經(jīng)過檢索數(shù)據(jù)庫,選擇ZEB1等5個基因為其候選靶基因,Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)miR-429組中ZEB1蛋白的表達量較另兩組降低(p0.05)。3.2熒光素酶報告系統(tǒng)顯示ZEB1為miR-429靶基因,而且可能主要由第一位點起作用。4結論：4.1 miR-429可以靶向作用于ZEB1,過表達miR-429對ZEB1基因的表達有抑制作用。4.2 miR-429對ZEB1的調控主要可能依賴于與第一處預測位點區(qū)域中(Position 369-376)的堿基對結合發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

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本文編號：1517991