本文關鍵詞： 膠質瘤 轉錄組 代謝組 缺氧 IF1 非小細胞肺癌 淋巴結轉移 預后　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分:缺氧對膠質瘤細胞基因表達和物質代謝的影響及其生物學意義目的:膠質瘤是顱內最常見的原發(fā)性腫瘤,其中惡性膠質瘤具有生存期短、易復發(fā)及難治療的特點。盡管近年來有大量的研究,從細胞、動物實驗及臨床水平探討揭示了惡性膠質瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制,并從手術、放療、化療、基因、靶向、免疫等方面深入探討了惡性膠質瘤的綜合治療方法。但是目前惡性膠質瘤患者術后平均生存期仍然不到1年,且大部分膠質瘤表現出對放化療極強的耐受性。其關鍵在于目前尚缺乏可用于惡性膠質瘤早期診斷的特異性標志物,以及可指導臨床進行靶向治療的特異性干預靶點。因此,積極研究尋找惡性膠質瘤的特異性標志物和特異性干預靶點對提高治療質量具有重要的理論意義和巨大的臨床應用價值。近年來,高通量測序技術和代謝物檢測分析技術的快速發(fā)展,為從基因及代謝產物等分子水平揭示惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制、尋找特異性生物標志物及特異性干預靶點提供了新的技術手段和實現路徑,因而在惡性腫瘤的研究中得以廣泛應用。惡性膠質瘤細胞的無限增殖、侵襲、耐藥以及高復發(fā)等特性除了與膠質瘤細胞自身的特性有關外,還與其以缺氧為特征的腫瘤微環(huán)境密切相關。但是,迄今為止,有關缺氧在膠質瘤細胞基因轉錄和物質代謝改變過程中的作用及其生物學意義尚不十分清楚。因此,本研究采用轉錄組學、代謝組學等技術方法系統(tǒng)研究了常氧及缺氧條件下惡性膠質瘤細胞基因轉錄和代謝物改變的表征,采用生物信息學方法分析揭示了惡性膠質瘤細胞中活化的生物過程和信號通路及其關鍵分子,并結合CCLE數據庫及惡性膠質瘤患者的組織和血液樣本對其進行了驗證,不僅為深入揭示惡性膠質瘤的發(fā)生發(fā)展機制提供了新的視角,而且為尋找惡性膠質瘤生物標志物及特異性治療靶點提供了實驗依據,最終為惡性膠質瘤患者的個性化治療提供了可能,對提高惡性膠質瘤的治療水平具有重要的理論意義和潛在應用價值。方法:1.轉錄組學生物信息分析以正常星形膠質細胞HEB和惡性膠質瘤細胞U87-MG作為模型,于21%和1%O2環(huán)境培養(yǎng)24h收集細胞總RNA行RNA-Seq檢測。轉錄組數據經原始測序數據質量評估及比對到人類參考基因組(hg19)后,采用R軟件包Nioseq計算差異表達基因,選取差異倍數≥2及偏離概率值≥0.8為顯著性閾值,篩選差異表達基因。根據上調差異基因在U87-MG細胞中的表達量值FPKM,選取FPKM≥1000、10≤FPKM1000及FPKM10為閾值將上調差異基因分為高表達、中度表達和低表達三類,以高表達組作為U87-MG細胞的特征性表達基因,結合蛋白互作數據庫Int Act、MINT、Matrix DB、DIP、I2D和Innate DB分析U87-MG細胞的生物學功能。使用Enrichr及REVIGO在線分析工具對差異表達基因進行GO功能注釋和KEGG通路分析。隨后使用CCLE數據庫對篩選出的U87-MG細胞核心通路及特征表達基因進行進一步驗證。以HEB細胞對缺氧環(huán)境的應答過程作為背景,結合CCLE數據庫中惡性膠質瘤各細胞系表達譜篩選在U87-MG細胞中持續(xù)表達的缺氧敏感性基因,并使用蛋白印跡在細胞中對STC1、HMOX1和TGFB1的蛋白表達進行檢測。2.GBM患者血液及組織標本驗證關鍵分子收集GBM病人血液及組織標本,離心后獲取血漿樣品,使用ELISA法對GBM病人血漿標本中炎癥相關分子IL1B、CSF3和TIMP1蛋白表達量進行檢測,采用免疫組化技術在GBM患者中對缺氧敏感基因STC1、HMOX1和TGFB1的蛋白表達及分布進行檢測。3.代謝組學分析以HEB和U87-MG細胞系作為模型,分別于21%和1%O2環(huán)境培養(yǎng)24h收集細胞行代謝組學檢測。樣本在質量控制的基礎上,行液相色譜-質譜分析得到色譜數據。通過R軟件提取色譜峰,進一步進行內參標準化和細胞數校準后。之后我們通過數據多變量統(tǒng)計分析(SIMCA-P12.0)和單變量統(tǒng)計分析(SPSS19.0),得到常氧U87-MG相較于HEB細胞以及缺氧環(huán)境下U87-MG和HEB細胞相較于其自身常氧的差異代謝物。通過在HMDB和METLIN數據庫進行驗證后,使用Metabo Analyst 3.0進行通路富集分析,結合KEGG數據庫,繪制代謝通路示意圖。進一步結合分析轉錄組中代謝酶的變化,探討膠質瘤的代謝表征和缺氧后的物質代謝變化。結果:1.與HEB細胞相比,在U87-MG細胞中共有5215個差異表達基因,其中上調基因2759個,下調基因2456個。上調基因主要富集在炎癥反應、血管生成及細胞運動等生物學過程,其中炎癥反應主要活化的通路為細胞因子間相互作用及Toll樣受體通路。2.U87-MG細胞差異上調基因中,篩選到特征表達基因12個,且其參與的通路均與炎癥反應、血管生成及細胞運動相關。其中惡性膠質瘤患者IL1B、CSF3和TIMP1蛋白表達量顯著高于健康體檢者。3.U87-MG細胞缺氧過程中,細胞分裂、DNA復制、三羧酸循環(huán)、線粒體轉運及ATP代謝過程受到抑制,而細胞內穩(wěn)態(tài)調節(jié)及脂質的細胞應答過程被激活。4.缺氧敏感基因STC1、HMOX1和TGFB1在U87-MG細胞中持續(xù)性高表達,且惡性膠質瘤患者腦組織中其蛋白表達顯著高于正常腦組織。5.U87-MG細胞與HEB細胞差異代謝物共119個,其中表達上調59個,下調60個,主要富集于三羧酸循環(huán)、脂質代謝、糖酵解、氨基酸及核酸代謝通路等代謝過程。與正常細胞HEB相比,膠質瘤細胞U87-MG糖酵解增強,氨基酸和脂代謝增強,但有氧氧化和核酸代謝減弱。6.1%O2環(huán)境處理U87-MG細胞時,氨基酸代謝和糖代謝的增強更為顯著。而1%O2環(huán)境處理HEB細胞時,脂肪酸合成和代謝則更為旺盛。結論:HEB和U87-MG細胞之間基因表達差異顯著,U87-MG細胞中炎癥反應、血管生成及細胞運動等生物學過程明顯活化。炎癥相關的Toll樣受體通路及細胞因子間相互作用信號通路在U87-MG細胞呈現高度活躍狀態(tài)。HEB和U87-MG細胞對缺氧刺激的應答模式明顯不同,U87-MG細胞中,細胞分裂、DNA復制、三羧酸循環(huán)、線粒體轉運及ATP代謝過程受到抑制,而細胞內穩(wěn)態(tài)調節(jié)及脂質的細胞應答過程被激活。同時炎癥相關因子IL1B、CSF3和TIMP1及缺氧敏感基因STC1、HMOX1和TGFB1有望成為GBM患者臨床早期診斷及組織病理診斷和預后評估的生物標志物。同時在代謝產物上,與HEB細胞相比U87-MG細胞糖酵解增強,氨基酸和脂代謝增強,但有氧氧化和核酸代謝減弱,而在缺氧時,氨基酸代謝和糖代謝的增強更為顯著。第二部分:IF1在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義目的:肺癌是當前世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤,其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在總的肺癌病人中占比高達85%。雖然目前NSCLC的手術治療、放療、化療以及基因治療方法已有較大進步,但治療效果仍然十分有限,總的治愈率在10%左右。其中主要原因是NSCLC的生物學特性復雜,惡性程度高,80%的肺癌患者在首次就診時已是晚期,因此,尋找新的腫瘤標志物是未來肺癌治療的突破口之一。ATP合酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor 1,IF1)在多種腫瘤中高表達,并且參與了腫瘤的代謝重編程。我們推測IF1可能作為NSCLC的潛在生物標志物。方法:對149例NSCLC標本進行IF1免疫組化染色評分。根據評分結果結合病人信息進行分析比較,統(tǒng)計分析IF1的表達與NSCLC患者臨床病理參數之間的聯(lián)系,以及與患者預后和復發(fā)的關聯(lián)。結果:1.IF1在NSCLC中的表達均顯著高于正常組織(p=0.034),晚期患者(TNM III/IV)的IF1表達水平顯著高于早期患者(TNM I/II)(p=0.033)。2.在NSCLC組織中,IF1的表達與患者的TNM分期(p=0.032)、淋巴結轉移與否(p=0.043)、吸煙與否(p=0.017)相關。TNM分期越晚,有淋巴結轉移,吸煙患者的IF1表達水平越高。3.IF1高表達的NSCLC患者的生存時間明顯短于IF1低表達的NSCLC患者(p=0.007),且IF1的高表達與否可以作為NSCLC組患者獨立的預后指標之一(HR=1.667,p=0.034)。在早期患者(TNM I/II)中IF1高表達的NSCLC患者的生存時間明顯短于IF1低表達的非小細胞肺癌患者(p=0.042),4.IF1高表達的NSCLC患者的復發(fā)率明顯高于IF1低表達的NSCLC患者(p=0.003)。結論:IF1在NSCLC組織中的表達顯著高于正常肺組織,并且與TNM分期和淋巴結轉移呈正相關。IF1可作為NSCLC患者獨立的預后和復發(fā)指標。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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