本文關(guān)鍵詞：肝癌HepG2細(xì)胞TAB182基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系的建立及其化療敏感性的研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是一種惡性程度高、治愈率低的臨床常見惡性腫瘤,居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第六位,病死率的第三位。目前治療肝癌的手段包括多種,如手術(shù)、放療、化療、分子靶向療法、肝動(dòng)脈化療栓塞以及中醫(yī)治療等�；瘜W(xué)治療仍是治療中晚期肝癌的重要手段。雖然不斷有新的化療藥物和化療方案推出,但是由于化療耐藥基因存在,使得化療藥物的療效存在很大的局限性,進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。近年來,隨著分子生物學(xué)理論和基因重組技術(shù)的成熟,有關(guān)肝癌耐藥基因的研究層出不窮,化療聯(lián)合基因治療顯示出廣闊的應(yīng)用前景。TAB182,又稱TNKS1BP1,是在通過酵母雙雜交試驗(yàn)研究與多聚ADP核糖聚合酶家族成員TNKS1的相互作用蛋白中首次被發(fā)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)室前期在大規(guī)模識(shí)別鑒定DNA雙鏈斷裂信號(hào)響應(yīng)與修復(fù)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子DNA-PKcs的磷酸化底物中發(fā)現(xiàn):TAB182可能參與電離輻射誘發(fā)DNA損傷應(yīng)激與信號(hào)響應(yīng)的調(diào)控,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TABl82基因沉默的細(xì)胞放射敏感性增加;TAB182能夠調(diào)節(jié)DNA雙鏈斷裂活化非同源末端連接信號(hào)通路,并且參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)。DNA或DNA代謝過程會(huì)因放射線及多種抗癌藥物的作用而受到直接或間接的影響,DNA受損后繼發(fā)DNA損傷修復(fù),而對(duì)DNA的修復(fù)結(jié)果就是使細(xì)胞生存率提高,基于這一原理,只要對(duì)DNA損傷修復(fù)過程加以抑制,就可以使細(xì)胞化療敏感性提高。順鉑是肝癌臨床治療中常見化療藥物。二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線藥物,除了具有胰島素增敏、降糖等作用,流行病學(xué)發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可以降低糖尿病患者罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn),并改善肝癌的預(yù)后。近期多項(xiàng)細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均提示二甲雙胍可抑制肝癌的增殖和浸潤轉(zhuǎn)移,可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡與周期阻滯和減少DNA損傷有關(guān),但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入探討�；诖�,筆者設(shè)想,TAB182基因參與DNA損傷修復(fù),增加腫瘤細(xì)胞放療敏感性,那么,沉默TAB182是否可以提高作用于DNA的化療藥物腫瘤殺傷效果?為此,本研究以脂質(zhì)體為載體,轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞,通過sh RNA技術(shù)調(diào)控TAB182的表達(dá),篩選出TAB182蛋白穩(wěn)定沉默的細(xì)胞,采用Cell Counting Kits-8(CCK-8)方法研究HepG2細(xì)胞TAB182基因沉默后對(duì)肝癌相關(guān)化療藥物敏感性的影響,為進(jìn)一步探索篩選肝癌的靶向基因治療提供依據(jù)。方法:1本課題選擇離體肝癌HepG2細(xì)胞作為研究對(duì)象,利用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的技術(shù)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,建立TAB182基因沉默細(xì)胞模型,通過潮霉素B篩選,建立TAB182基因沉默的單克隆HepG2細(xì)胞系,即HepG2-sh-TAB182細(xì)胞系。HepG2-NC作為陰性對(duì)照,也就是把和人類編碼基因不存在同源性的載體或片段與轉(zhuǎn)染細(xì)胞相連接。2通過Western blot的方法檢測HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞TAB182蛋白表達(dá)情況。3通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度順鉑(1、2、4、8μg/m L)、二甲雙胍(5、10、20、40 mmol/L)在不同作用時(shí)間(24h、48h和72h)下對(duì)HepG2-sh-TAB182及HepG2-NC細(xì)胞增殖抑制作用的差異與特征規(guī)律,并繪制相應(yīng)的作用曲線。4采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn),P0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:1經(jīng)Western blot技術(shù)檢測顯示:轉(zhuǎn)染TAB182基因沉默sh RNA質(zhì)粒的肝癌HepG2細(xì)胞,TAB182蛋白不表達(dá),TAB182基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系成功建立。2 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)表明:1)順鉑、二甲雙胍作用于HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞,隨著藥物濃度增加及作用時(shí)間的延長,各組HepG2細(xì)胞增值抑制率逐漸增高,差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2)給予順鉑、二甲雙胍處理,在相同作用濃度及作用時(shí)間下,HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與HepG2-NC相比,細(xì)胞增殖抑制率顯著增高,差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1本研究成功構(gòu)建了肝癌HepG2細(xì)胞TAB182基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系(HepG2-sh-TAB182細(xì)胞系)。2抑制TAB182基因表達(dá)能增加肝癌HepG2細(xì)胞對(duì)順鉑的藥物敏感性,其機(jī)制有待進(jìn)一步研究;3二甲雙胍具有抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖作用,抑制TAB182基因表達(dá)能增加肝癌細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的藥物敏感性,其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1352525