本文關(guān)鍵詞：新型分泌蛋白Canopy2在結(jié)直腸腺癌生長和發(fā)展中的作用研究

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【摘要】：目的:近年來腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直呈現(xiàn)持續(xù)增高的趨勢,其中血管生成(angiogenesis)是腫瘤生長和發(fā)展的一個(gè)重要促進(jìn)因素。正常情況下,機(jī)體內(nèi)促血管生成與抑制血管生成因子之間保持一種動(dòng)態(tài)平衡,維持血管系統(tǒng)的正常狀態(tài)來保持機(jī)體各組織器官正常的營養(yǎng)所需。在腫瘤發(fā)展過程中,由于各種原因?qū)е履[瘤細(xì)胞過度增生,為了滿足營養(yǎng)所需,大量的新生血管在瘤體組織中產(chǎn)生,以供給所需的營養(yǎng)物質(zhì),促血管生成因子在此過程發(fā)揮重要的作用。已有研究表明,抑制腫瘤的血管生成,可以有效抑制腫瘤的生長,發(fā)揮一定的抗腫瘤作用�？鼓[瘤血管生成已成為腫瘤治療的新型靶點(diǎn)之一。近期研究表明,Canopy2(CNPY2)是一種新型的分泌型促血管生成因子,具有促進(jìn)主動(dòng)脈環(huán)新生血管發(fā)生和生長的效果。因此,CNPY2可能通過促血管生成作用而參與在腫瘤的發(fā)生發(fā)展。結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是人類腫瘤的一類高發(fā)類型,最新數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率和死亡率分別占據(jù)腫瘤疾病的第三和第四位。與其他各類型腫瘤相同,目前結(jié)腸癌的發(fā)病和生長機(jī)制仍未明確。課題組在研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的癌組織和血漿中,CNPY2水平顯著增高,提示CNPY2可能參與結(jié)直腸癌生長和發(fā)展,但是確切作用和影響尚不清楚。因此,本課題針對(duì)結(jié)直腸癌,研究了CNPY2在結(jié)腸癌生長和發(fā)展中的作用研究。通過使用結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞,knockdown細(xì)胞CNPY2水平,分別在體外細(xì)胞和體內(nèi)移植瘤中開展CNPY2在結(jié)直腸癌生物學(xué)活性的作用研究,包括腫瘤的生長、遷移/浸潤和凋亡,綜合評(píng)價(jià)CNPY2作為結(jié)直腸癌的臨床預(yù)防或預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)及治療新靶點(diǎn)的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。方法:1.檢測臨床結(jié)直腸癌患者CNPY2表達(dá)水平隨機(jī)選取臨床結(jié)直腸癌患者,在患者進(jìn)行手術(shù)切除腫瘤的治療的過程中,收集患者的癌組織和癌旁正常組織(距癌組織15cm)樣品,以及結(jié)直腸腺癌患者術(shù)前和正常健康人的血漿樣品。組織進(jìn)行RNA、蛋白提取或福爾馬林固定制備石蠟包塊,分別進(jìn)行人CNPY2的RT-PCR、Western blotting檢測和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色。通過ELISA法,測定血漿CNPY2蛋白的水平。2.構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh RNA質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞系通過sh RNA(short hairpin RNA)knockdown細(xì)胞內(nèi)源性CNPY2基因表達(dá)的方式,選擇質(zhì)粒p RFP-C-RS-sh RNA-human CNPY2和p RFP-C-RS-sh RNA-control,采取Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞116(human colorectal tumor cell116,HCT116細(xì)胞)。細(xì)胞培養(yǎng)中采取嘌呤霉素(0.5ug/ml)篩選21天,隨后有限稀釋法進(jìn)行挑選單個(gè)陽性表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞、擴(kuò)增,獲得單細(xì)胞克隆。提取細(xì)胞RNA、蛋白和培養(yǎng)上清,分別進(jìn)行RT-PCR、Western blotting和ELISA,檢測細(xì)胞內(nèi)源性CNPY2 knockdown的效率。最終成功構(gòu)建兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh RNA質(zhì)粒的細(xì)胞系:HCT116sh RNA-CNPY2細(xì)胞和HCT116sh RNA-control細(xì)胞。3.檢測CNPY2對(duì)HCT116細(xì)胞部分生物學(xué)活性的影響利用構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HCT116sh RNA-CNPY2細(xì)胞和HCT116sh RNA-control細(xì)胞,分別采用CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)法、克隆形成、劃痕愈合試驗(yàn)、細(xì)胞Annexin V和PI雙染流式計(jì)數(shù)的方法,觀察CNPY2在HCT116細(xì)胞的生長、遷移和凋亡的作用。4.CNPY2對(duì)裸鼠移植瘤生長的影響裸鼠皮下等位注射HCT116sh RNA-CNPY2細(xì)胞和HCT116sh RNA-control細(xì)胞,觀察和記錄移植瘤生長情況。21天后,收集移植瘤,測量瘤體大小、重量反映移植瘤生長情況。移植瘤用于制備石蠟包塊、切片,分別進(jìn)行增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、CD105和TUNEL染色,反映CNPY2在瘤體增殖、血管生成和凋亡的影響。結(jié)果:1.CNPY2在結(jié)直腸癌癌組織水平明顯高于癌旁正常組織(p0.01),并且CNPY2的來源主要是癌細(xì)胞分泌的;患者血漿CNPY2水平是正常健康人的1.72倍(p0.01)。2.成功構(gòu)建了抑制HCT116細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)源性CNPY2表達(dá)的sh RNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HCT116sh RNA-CNPY2細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞系HCT116sh RNA-control細(xì)胞。3.體外knockdown CNPY2后,引起細(xì)胞增殖和遷移的減弱,而促進(jìn)化療藥奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。4.體內(nèi)瘤體CNPY2的抑制,降低了移植瘤的生長速度和血管生成情況,增加了瘤體的凋亡。結(jié)論:在結(jié)直腸癌的癌組織中癌細(xì)胞高表達(dá)CNPY2,導(dǎo)致癌組織和患者血漿CNPY2水平明顯高于正常組織和健康人群,提示CNPY2參與結(jié)直腸癌生長和發(fā)展。通過HCT116細(xì)胞中開展CNPY2作用研究,CNPY2可能通過促進(jìn)細(xì)胞生長、遷移、血管生成和抑制凋亡,在結(jié)腸癌的生長和浸潤中發(fā)揮作用。通過本研究,闡述了CNPY2引起的結(jié)直腸癌的生物學(xué)改變,為后續(xù)與CNPY2有關(guān)的結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制方面研究指出了方向。臨床結(jié)腸癌患者血漿CNPY2水平的顯著增高,提示CNPY2可能是結(jié)腸癌治療新靶點(diǎn)和評(píng)價(jià)預(yù)后的新指標(biāo)。此外,CNPY2的下調(diào)引起奧沙利鉑誘導(dǎo)凋亡的增加,對(duì)于臨床治療中針對(duì)部分耐受化療藥患者的治療研究是具有重要的參考價(jià)值的。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34

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