本文關(guān)鍵詞：RNAi沉默RPL34基因?qū)θ宋赴㏒GC-7901細胞增殖和周期的影響

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【摘要】：目的:胃癌是最常見的消化道腫瘤之一,胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多階段、涉及多個基因參與的復(fù)雜過程。RPL34基因被認為在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控腫瘤細胞的分化、增殖和凋亡等多個生物學途徑。本研究通過構(gòu)建RPL34特異性si RNA慢病毒載體,感染胃癌SGC-7901細胞,設(shè)置陰性對照組和干擾組,應(yīng)用Real-time PCR方法檢測兩組細胞干擾的效果,MTT法檢測RPL34在RNAi作用下的細胞增殖率,流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化。通過本實驗為進一步研究RPL34基因應(yīng)用于腫瘤基因治療奠定基礎(chǔ),為胃癌的治療提供新的策略。方法:1.重組慢病毒感染胃癌SGC-7901細胞將胃癌SGC-7901細胞分為兩組,實驗組和陰性對照組分別轉(zhuǎn)染RPL34-si RNA慢病毒載體和si RNA陰性對照慢病毒載體。感染前將胃癌細胞接種于6孔板,培養(yǎng)24h后,加入慢病毒濃縮液20ul進行感染,72h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況,計算感染效率。2.Real-time PCR檢測RNAi對目的基因的干擾效果Trizol法抽提細胞RNA,采用Oligo(d T)引物和隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄,以各組細胞c DNA作為模板,每組設(shè)立3個復(fù)孔進行Real-time定量PCR檢測。3.MTT法檢測RPL34基因在RNAi作用下的細胞增殖率取2組對數(shù)生長期細胞接種于96孔板,每組設(shè)立3個復(fù)孔,分別在接種后1、2、3、4和5d每孔加入濃度為5g/L MTT溶液10ul,培養(yǎng)4h后棄去上清,每孔加入DMSO100ul,震蕩溶解后,使用酶標儀在490nm波長處測定吸光度(A)值,記錄結(jié)果并繪制細胞生長曲線。4.利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期胰酶消化經(jīng)慢病毒感染后處于對數(shù)生長期細胞,使細胞完全分散為單個細胞,然后用預(yù)冷的PBS液洗滌3次,15000rpm離心10min后收集細胞,棄去上清,加入1ml預(yù)冷PBS液重懸細胞,加入PI(1:100)及RNase(1:100)避光冰浴10min,流式細胞儀檢測細胞周期。結(jié)果:濃縮后的重組慢病毒感染人胃癌SGC-7901細胞,48h后在熒光顯微鏡下觀察到細胞綠色熒光表達強度高,細胞生長狀態(tài)良好,表明慢病毒已穩(wěn)定感染胃癌細胞。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,與陰性對照組對比,實驗組RPL34表達水平明顯受到抑制(P0.05),提示RPL34-si RNA能有效沉默胃癌SGC-7901細胞的RPL34基因。MTT實驗結(jié)果提示實驗組細胞較陰性對照組總體生長速度降低(P0.05),提示靶向抑制RPL34基因表達后可顯著降低胃癌細胞的增殖活力。流式細胞儀檢測細胞周期實驗提示實驗組S期細胞明顯減少(P0.05),而G2/M期細胞增加(P0.05),說明RPL34基因表達下調(diào)后,細胞有絲分裂明顯減緩,細胞增殖受到明顯抑制,促進細胞凋亡。結(jié)論:1.慢病毒介導(dǎo)的RNAi能穩(wěn)定有效地下調(diào)RPL34基因的表達。2.抑制RPL34基因的表達后,胃癌SGC-7901細胞的生長速率和有絲分裂明顯減緩。3.RPL34基因在維持胃癌細胞生物學方面發(fā)揮重要作用,可能為胃癌的基因靶向治療提供新的思路。
【學位授予單位】：皖南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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3 石s，

本文編號：1242762