本文關(guān)鍵詞：ω-3多不飽和脂肪酸對結(jié)腸癌細胞的作用及機制研究

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【摘要】：目的已有報道ω-3多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)能夠抑制腫瘤的發(fā)生和腫瘤細胞的增殖,但作用機制尚未完全清楚。YAP作為Hippo通路中的核心蛋白,在腫瘤的發(fā)生及增殖中起重要作用。本研究擬觀察ω-3 PUFAs DHA和EPA對結(jié)腸癌細胞的作用;探討相應(yīng)的作用機理;揭示ω-3 PUFAs DHA和EPA作用于結(jié)腸癌細胞的信號通路,為預防結(jié)腸癌的發(fā)生和輔助治療提供理論依據(jù)和候選藥物。方法1.通過MTT法觀察DHA和EPA對結(jié)腸癌細胞HT-29和LOVO增殖的影響;流式細胞術(shù)觀察DHA和EPA對HT-29和LOVO細胞凋亡的影響。2.DHA和EPA處理HT-29和LOVO細胞,通過Western Blot檢測上述細胞中YAP及其磷酸化YAP(p-YAP)的水平;并對比不同濃度梯度DHA和EPA的作用結(jié)果,確定最適作用濃度。3.DHA和EPA處理HT-29和LOVO細胞,激光共聚焦顯微技術(shù)(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察細胞中YAP的核漿定位。4.采用RNA干擾技術(shù)沉默YAP的表達,DHA和EPA處理干擾YAP后的HT-29和LOVO細胞,通過實時熒光定量PCR檢測上述細胞中YAP靶基因mRNA的變化。5.DHA和EPA處理HT-29和LOVO細胞后,通過Western Blot檢測上述細胞中LATS及其磷酸化LATS(p-LATS)的變化。6.分別干擾Hippo通路中LATS及MST,DHA和EPA處理干擾后HT-29和LOVO細胞,通過Western Blot檢測上述細胞中YAP及p-YAP的變化。7.通過免疫組織化學技術(shù)(Immunohistochemistry,IHC)檢測人結(jié)腸癌組織與正常腸組織中G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)GPCR40和GPCR120是否存在。8.分別干擾GPCR40和GPCR120,DHA和EPA處理干擾后HT-29和LOVO細胞,通過Western Blot檢測上述細胞中LATS及p-LATS。9.在HT-29和LOVO細胞中過表達突變型的Gs蛋白后,DHA和EPA處理上述細胞,通過Western Blot檢測上述細胞中p-YAP和p-LATS。10.用pka的抑制劑h89處理ht-29和lovo細胞,dha和epa處理上述細胞,通過westernblot檢測上述細胞p-yap和p-lats。結(jié)果1.mtt實驗結(jié)果表明dha和epa對結(jié)腸癌細胞的增殖有抑制作用,并且有時間和濃度依賴性。2.流式細胞術(shù)結(jié)果表明dha和epa促進結(jié)腸癌細胞的凋亡。3.westernblot結(jié)果表明dha和epa促進結(jié)腸癌細胞p-yap增加,且有時間和濃度依賴性。4.激光共聚焦試驗結(jié)果顯示:dha和epa能促進yap的核漿轉(zhuǎn)移。5.實時熒光定量pcr結(jié)果顯示:dha和epa處理結(jié)腸癌細胞后,yap的靶基因(促增殖基因及抗凋亡基因)在mrna水平上明顯下降;dha和epa處理沉默yap后的結(jié)腸癌細胞,yap的靶基因(促增殖基因及抗凋亡基因)在mrna水平上不再變化,說明dha和epa降低這些基因mrna水平是通過yap起作用的。6.westernblot結(jié)果顯示dha和epa使p-lats增加,且有時間和濃度依賴性。7.westernblot結(jié)果顯示:分別干擾lats和mst后,p-yap水平下降,再用dha和epa處理細胞后不能使p-yap增加。8.免疫組織化學試驗結(jié)果顯示gpcr40和gpcr120在人結(jié)腸癌中表達。9.westernblot結(jié)果顯示:分別干擾gpcr40和gpcr120后,再用dha和epa處理細胞后不能使p-yap和p-lats增加。10.在ht-29和lovo細胞中過表達突變型gs后,發(fā)現(xiàn)p-yap和p-lats下降,再用dha和epa處理細胞后不能使p-yap和p-lats增加。11.h89處理ht-29和lovo細胞,結(jié)果顯示p-yap和p-lats下降,再用dha和epa處理細胞后不能使p-yap和p-lats增加。結(jié)論1.dha和epa對ht-29和lovo細胞有抑制其增殖并促進其凋亡的作用,且有時間和濃度依賴性。2.dha和epa能促進ht-29和lovo細胞中yap的磷酸化,且使蛋白yap的核內(nèi)定位減少。3.dha和epa使蛋白yap的靶基因包括促增殖及抑凋亡基因的轉(zhuǎn)錄減少。4.DHA和EPA通過Hippo通路促進LATS的磷酸化。5.DHA和EPA通過與GPCR40和GPCR120結(jié)合,促進YAP和LATS的磷酸化。6.DHA和EPA通過Gs下游蛋白激酶PKA,與Hippo通路關(guān)聯(lián),抑制細胞增殖和促進細胞凋亡。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35

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本文編號：1206343