本文關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序技術(shù)在骨髓增殖性腫瘤臨床檢測(cè)中的方法學(xué)建立及其初步應(yīng)用

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【摘要】：研究背景與目的：骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms, MPN)是一組起源于造血干細(xì)胞的惡性骨髓增殖性疾病,以外周血一系或多系細(xì)胞增多,易發(fā)生血栓和出血等并發(fā)癥,自發(fā)性向急性白血病和骨髓纖維化轉(zhuǎn)化為共同臨床特點(diǎn)的一類髓系增殖性疾病。1960年在慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)中發(fā)現(xiàn)Ph染色體；然而在隨后的半個(gè)多世紀(jì)里,對(duì)于Ph陰性的MPN遺傳學(xué)背景知之甚少。2005年獲得性點(diǎn)突變JAK2V617F的發(fā)現(xiàn),使MPN的研究迅速進(jìn)入基因組時(shí)代。在隨后的10年,MPL (TPO受體)突變、JAK2第12外顯子的突變及編碼鈣網(wǎng)蛋白(CALR)的基因第9號(hào)外顯子突變相繼發(fā)現(xiàn)并被報(bào)道。JAK2V617F、MPL、JAK2第12外顯子以及CALR基因突變的發(fā)現(xiàn),使更多MPN患者找到了有力的診斷依據(jù)。目前,越來(lái)越多文獻(xiàn)報(bào)道兩種或多種基因突變同時(shí)存在的MPN病例,不同表型的MPN可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化甚至進(jìn)展為急性髓系白血病,單一的分子突變已無(wú)法解釋此類MPN患者臨床表現(xiàn)型的多樣化。檢測(cè)多個(gè)分子以及綜合考慮各種分子學(xué)突變,才能更進(jìn)一步了解MPN的發(fā)病機(jī)制、準(zhǔn)確評(píng)估患者的預(yù)后以及實(shí)現(xiàn)對(duì)MPN患者的個(gè)體化治療�？焖佟�(zhǔn)確和全面地獲取MPN患者的DNA分子遺傳信息對(duì)于臨床研究以及指導(dǎo)臨床治療具有十分重要的意義。對(duì)于每個(gè)生物體來(lái)說(shuō),其基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。測(cè)序技術(shù)能夠真實(shí)地反映患者基因組DNA上的遺傳信息,進(jìn)而比較全面地揭示患者基因組DNA的復(fù)雜性和多樣性。1977年Sanger發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法,標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生。Sanger測(cè)序迄今為止仍是DNA測(cè)序的主流方法,但是測(cè)序速度慢、成本高、通量小使得傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要。新一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)是一次可對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定的高通量測(cè)序技術(shù)。新一代測(cè)序技術(shù)具有速度快、準(zhǔn)確度高、成本低、覆蓋度深和產(chǎn)出巨大等優(yōu)點(diǎn),研究者可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)感興趣的基因進(jìn)行精確定位和分析,在臨床檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用前景。Ion TorrentPGM測(cè)序儀是一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代測(cè)序技術(shù),通過(guò)專有的大規(guī)模并行半導(dǎo)體感應(yīng)器,對(duì)于DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的離子流,實(shí)現(xiàn)直接和實(shí)時(shí)的檢測(cè)。IonTorrent技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、速度快、靈活性大等優(yōu)點(diǎn)。目前已應(yīng)用于多領(lǐng)域的研究,如癌癥、遺傳疾病、婦嬰健康領(lǐng)域、血液相關(guān)疾病、微生物研究和生物學(xué)基礎(chǔ)研究等。Thermo Life公司推出的AmpliSeq建庫(kù)方案,該技術(shù)僅利用20ng樣品就可在一管中同時(shí)擴(kuò)增6144種PCR片段,使科研人員能快速的分析成千上萬(wàn)個(gè)目標(biāo)基因。目前Thermo Life已推出了商業(yè)化Cancer Hotspot Panel,其中大多基因涉及的是實(shí)體腫瘤,其對(duì)血液系統(tǒng)疾病的研究還較少。Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)的可擴(kuò)展性允許研究人員可以自由的選擇感興趣的幾十甚至幾百個(gè)基因定制多重PCR引物試劑盒。通過(guò)查閱大量文獻(xiàn),我們定制了MPN致病相關(guān)基因的多重PCR引物試劑盒,包括JAK2、MPL、CALR、KIT、ASXL1、IDH1、 IDH2、LNK、CBL、TET2、EZH2、DNMT3A、U2AF1、SRSF2、SF3B1、CSF3R、 TP53、SOCS1、SOCS2、SOCS3、NRAS、KRAS及NEF共23種基因。本課題第一部分的目的是在于研究Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)及定制的MPN多重引物試劑盒在骨髓增殖性腫瘤臨床診斷中的方法學(xué)建立。結(jié)合近年來(lái)的研究,約95%-98%的PV (Polycythemia vera)、約50%-60%的ET (Essential thrombocythemia)及PMF (Primary myelofibrosis)患者存在JAK2突變,約4%的ET患者及8%的PMF患者存在MPL突變,CALR突變?cè)赑V患者中罕見,在ET患者中的突變率約為15%-24%,在PMF患者中的突變率約為25%-35%左右。然而,仍有15%的MPN病人不存在以上三種突變,此類MPN歸類于三陰性MPN。目前對(duì)于三陰性的MPN,因?yàn)槿狈θN主要的分子學(xué)突變,造成其診斷困難。本課題第二部分的目的在于研究三陰性MPN患者的分子學(xué)異常,通過(guò)新一代測(cè)序技術(shù)獲得三陰性MPN疾病相關(guān)基因序列信息,為臨床醫(yī)生提供診斷依據(jù)。研究對(duì)象：1、收集2015年1月至2015年10月就診于南方醫(yī)院并診斷為Ph陰性的MPN患者骨髓標(biāo)本10例,10例患者均已行Sanger測(cè)序法檢測(cè)JAK2和CALR基因。4例JAK2V617F陽(yáng)性患者,4例CALR基因突變陽(yáng)性患者(2例CALR基因52bp缺失,2例CALR基因5bp插入),2例JAK2V617F和CALR基因突變同時(shí)存在的患者(1例CALR基因52bp缺失,1例CALR基因3bp缺失)。2、收集2015年1月至2015年10月就診于南方醫(yī)院并確診為Ph陰性的MPN患者骨髓標(biāo)本10例,10例患者均已經(jīng)Sanger測(cè)序法檢測(cè)JAK2和CALR基因陰性,ET病人骨髓標(biāo)本6例,CNL病人骨髓標(biāo)本1例,PMF病人骨髓標(biāo)本3例。研究方法：1、篩選目的基因、定制MPN多重PCR引物試劑盒利用Ion AmpliSeq Designer引物設(shè)計(jì)工具,對(duì)通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)獲得的23個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行多重PCR引物設(shè)計(jì),定制MPN多重PCR引物試劑盒。2、DNA提取按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作,提取骨髓細(xì)胞DNA。3、Sanger測(cè)序用經(jīng)典的Sanger測(cè)序方法檢測(cè)MPN患者的MPL基因突變情況。4、Ion Torrent PGM測(cè)序1)文庫(kù)構(gòu)建檢測(cè)DNA濃度,加無(wú)酶水稀釋到10ng/ul。按照試劑盒說(shuō)明書操作,擴(kuò)增目的基因DNA、消化引物、加barcode接頭、純化擴(kuò)增文庫(kù),最后定量文庫(kù)。2)模板制備分別在Ion OneTouch Two和Ion OneTouch ES儀器上進(jìn)行乳液PCR和陽(yáng)性模板富集。3) Ion Torrent PGM測(cè)序?qū)⒅苽涞哪０寮又罥on 316芯片上,在PGM測(cè)序儀上測(cè)序,測(cè)序原始數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在Ion Torrent PGM服務(wù)器上,用ionreporter (ionreporter.thermofisher.com)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)一步分析。結(jié)果：1、Ion Ampliseq Designer設(shè)計(jì)MPN多重PCR引物用Ion Ampliseq Designer對(duì)23個(gè)MPN致病相關(guān)基因設(shè)計(jì)多重PCR引物,結(jié)果如下：該MPN panel大小為52.42kb,共有283個(gè)擴(kuò)增子,可以覆蓋97.28%的目標(biāo)區(qū)域,PCR擴(kuò)增在兩管內(nèi)完成,分別有145和138個(gè)擴(kuò)增子,擴(kuò)增子的長(zhǎng)度在125bp和275bp之間。2、Sanger檢測(cè)MPL突變情況對(duì)第一部分和第二部分共20例MPN患者的MPL基因進(jìn)行Sanger測(cè)序,20例MPN患者M(jìn)PL基因突變均為陰性。3、Ion Torrent PGM測(cè)序質(zhì)控以一張316芯片為例,芯片中磁珠覆蓋率為66%,產(chǎn)生原始測(cè)序數(shù)據(jù)236Mb。磁珠文庫(kù)連接率為100%,其中33%磁珠連接多克隆文庫(kù),67%磁珠連接單克隆文庫(kù)。所有單克隆文庫(kù)中,除去1%測(cè)試片段,12%接頭二聚體,10%低質(zhì)量文庫(kù),最終有效單克隆文庫(kù)為77%,有效讀取片段共2,159,538個(gè)。片段平均讀長(zhǎng)為181bp,中位讀長(zhǎng)為196bp。不同位置的堿基平均讀取準(zhǔn)確度為99.3%。其中達(dá)到AQ20(與參考序列99%匹配)標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)為207 Mb。Ion Torrent PGM測(cè)序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：磁珠覆蓋率60%,磁珠文庫(kù)連接率80%,連接多克隆文庫(kù)磁珠40%,測(cè)試片段5%。整張芯片測(cè)序質(zhì)控達(dá)到Ion Torrent PGM測(cè)序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以樣品P1為例,單個(gè)樣品測(cè)序質(zhì)控結(jié)果顯示：讀取71,322,697個(gè)堿基,能達(dá)到AQ20標(biāo)準(zhǔn)的堿基數(shù)為64,123,648,平均測(cè)序深度為1,302×。4、Ion Torrent PGM測(cè)序結(jié)果分析1)對(duì)10例已經(jīng)用Sanger測(cè)序法檢測(cè)JAK2、MPL和CALR三個(gè)基因的MPN患者進(jìn)行Ion Torrent PGM測(cè)序,就JAK2、MPL、CALR三個(gè)基因而言,3例CALR基因52bp缺失均未被Ion Torrent PGM測(cè)序檢出,其余測(cè)序結(jié)果與Sanger測(cè)序結(jié)果完全吻合。Ion Torrent PGM測(cè)序結(jié)果可以顯示基因位置、突變類型、氨基酸的改變和測(cè)序深度,最重要的是Ion Torrent PGM測(cè)序能顯示突變所占的比例,從而對(duì)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷進(jìn)行定量。2)10例三陰性MPN患者Ion Torrent PGM測(cè)序結(jié)果顯示：1例ET患者未檢測(cè)出基因突變,其余9例患者均檢測(cè)到突變,突變個(gè)數(shù)為1.3個(gè)。其中最常見的為表觀遺傳修飾基因TET2突變,4例患者檢測(cè)出TET2基因突變。1例慢性中性粒細(xì)胞白血病病人檢測(cè)出CSF3RT618I突變。1例PMF患者檢測(cè)出TP53基因突變。除此之外,突變還涉及剪接體基因、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因等。結(jié)論：1、本研究結(jié)合自己定制的MPN多重PCR引物試劑盒和Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái),成功的建立了一套靈敏特異、快速、高通量的MPN致病相關(guān)基因突變檢測(cè)方法。Ion Torrent PGM測(cè)序能對(duì)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷進(jìn)行定量,為臨床醫(yī)生評(píng)估患者治療療效提供了依據(jù)。2、Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)對(duì)長(zhǎng)片段的缺失檢出存在缺陷,需要進(jìn)一步優(yōu)化平臺(tái)。3、幾乎所有的三陰性MPN患者都存在基因突變,其中表觀遺傳修飾基因TET2突變最常見。此外突變還涉及剪接體基因、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因等。
【關(guān)鍵詞】：骨髓增殖性腫瘤 基因突變 Ion Torrent PGM 測(cè)序
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.3
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 高通量測(cè)序平臺(tái)在骨髓增殖性腫瘤臨床診斷中的方法學(xué)建立16-48
• 前言16-21
• 1 材料和方法21-33
• 2 結(jié)果33-44
• 3 討論44-48
• 第二章 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)三陰性骨髓增殖性腫瘤基因突變48-64
• 前言48
• 1 材料和方法48-49
• 2 結(jié)果49-53
• 3 討論53-64
• 參考文獻(xiàn)64-79
• 全文小結(jié)79-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果80-81
• 致謝81-82

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本文編號(hào)：1070174