本文關(guān)鍵詞：去泛素化酶USP27x在細(xì)胞中的分子功能及與腫瘤的關(guān)系

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【摘要】：去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)通過(guò)水解泛素羧基末端的肽鍵、異肽鍵或者酯鍵,將泛素小分子特異性地從靶蛋白或前體蛋白上水解下來(lái),以保護(hù)靶蛋白不通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解。USP27x (Ubiquitin Carboxyl-terminal Hydrolase 27)是去泛素化酶中USP家族的一員,開(kāi)放閱讀框具有1317bp,編碼438個(gè)氨基酸,具有一個(gè)USP活性催化域。生物信息學(xué)分析表明USP27X與同家族的USP22氨基酸序列具有82%的一致性,但至今對(duì)USP27x的研究非常少,其生化特征和生物學(xué)功能仍然不清楚。本課題研究發(fā)現(xiàn)USP27x在人體各組織中都有表達(dá),其中肝臟、胰腺表達(dá)量為最高,肺、乳腺中表達(dá)量較低。免疫組化和免疫熒光的結(jié)果表明USP27x主要定位于細(xì)胞質(zhì),但是與其高度同源的USP22卻定位于細(xì)胞核。USP27x與USP22在細(xì)胞內(nèi)定位上的明顯差異,表明USP27x在細(xì)胞內(nèi)可能具有不同于USP22的分子功能。為了明確USP27x是否對(duì)其它分子具有調(diào)控的能力,我們首先在體外明確USP27x為具有功能活性的去泛素化酶,然后通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)USP27x,篩查細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的變化,發(fā)現(xiàn)USP27x的增加可導(dǎo)致p21蛋白表達(dá)量的增加,而這種增加在使用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞后消失,表明USP27x能通過(guò)蛋白酶體途徑影響p21的蛋白水平。USP27x對(duì)p21的調(diào)控能力,促使我們推測(cè)USP27x可能介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。為了明確這種作用,我們通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)USP27x可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖。通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)USP27x導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期減少,S期增加,促進(jìn)細(xì)胞周期G1期向S期的轉(zhuǎn)換。本研究初步揭示了去泛素化酶USP27x的生化特征、在細(xì)胞中的分子功能以及與腫瘤的關(guān)系,為進(jìn)一步深入研究USP27x在細(xì)胞中的功能作用,揭示其介導(dǎo)腫瘤增殖的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：腫瘤 USP27x 去泛素化酶 亞細(xì)胞定位
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 中英文縮寫對(duì)照8-13
• 第一章 緒論13-22
• 1.1 泛素-蛋白酶體途徑13-16
• 1.1.1 泛素14
• 1.1.2 泛素活化酶(E1)14
• 1.1.3 泛素結(jié)合酶(E2)14-15
• 1.1.4 泛素-蛋白連接酶(E3)15
• 1.1.5 26S蛋白酶體15-16
• 1.2 去泛素化16-20
• 1.2.1 去泛素化酶的分類16-19
• 1.2.2 去泛素化酶的功能19-20
• 1.3 本課題的研究目的、內(nèi)容和意義20-22
• 第2章 USP27x蛋白的序列分析及在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與定位22-41
• 2.1 前言22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器22-24
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材22-23
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-34
• 2.3.1 序列分析24
• 2.3.2 試劑配制24-25
• 2.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 2.3.4 質(zhì)粒pCMV-tag2b-3xFlag-USP27x的構(gòu)建26-31
• 2.3.5 質(zhì)粒的表達(dá)31
• 2.3.6 蛋白質(zhì)檢測(cè)31-33
• 2.3.7 免疫熒光(Immunofluorescence,IF)33
• 2.3.8 免疫組化33-34
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-40
• 2.4.1 USP27x的序列分析34-36
• 2.4.2 Flag-USP27x表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建36
• 2.4.3 USP27x和USP22抗體特異性檢測(cè)36-37
• 2.4.4 USP27x和USP22亞細(xì)胞定位37-39
• 2.4.5 USP27x在不同組織中的表達(dá)39-40
• 2.5 小結(jié)與討論40-41
• 第3章 USP27x去泛素化酶活性及調(diào)控分子的鑒定41-53
• 3.1 前言41-42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器42
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材42
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法42-48
• 3.3.1 試劑配制42-43
• 3.3.2 質(zhì)粒pCold Ⅱ-USP27x的構(gòu)建43-46
• 3.3.3 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)與蛋白純化46-47
• 3.3.4 去泛素化酶活性驗(yàn)證47-48
• 3.3.5 考馬斯亮藍(lán)的染色,檢測(cè)USP27x的表達(dá)48
• 3.3.6 抗體篩選USP27x底物48
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-52
• 3.4.1 pCold Ⅱ-USP27x表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建48-49
• 3.4.2 USP27x重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)49-50
• 3.4.3 USP27x去泛素化酶活性分析50-51
• 3.4.4 USP27x在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控分子的篩選51-52
• 3.4.5 USP27x通過(guò)蛋白酶體途徑調(diào)控p2152
• 3.5 小結(jié)與討論52-53
• 第4章 USP27x的生物學(xué)功能53-59
• 4.1 前言53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料53-54
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材53
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備53-54
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法54-56
• 4.3.1 所需試劑的配制54
• 4.3.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)54-55
• 4.3.3 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)55-56
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-57
• 4.4.1 USP27x促進(jìn)細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換56
• 4.4.2 USP27x促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖56-57
• 4.5 小結(jié)與討論57-59
• 結(jié)論和展望59-60
• 1 結(jié)論59
• 2 展望59-60
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 附錄A 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄65-66
• 致謝66-67

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本文編號(hào)：1065981