本文關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌相關(guān)基因KPNA2的篩選驗(yàn)證及其作用機(jī)制研究

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【摘要】：結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)惡性腫瘤之一,在我國(guó),結(jié)腸癌的發(fā)病率不斷增加,已成為最常見(jiàn)的惡性腫瘤。目前,結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的功能異�？梢鸢┗蚣耙职┗虻霓D(zhuǎn)運(yùn)及定位功能異常,因此,細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白可以作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。本課題聚焦于核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白家族,通過(guò)Real-time PCR篩選該家族內(nèi)與結(jié)腸癌相關(guān)的基因,經(jīng)過(guò)Western blot驗(yàn)證,并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析包含203例樣品的結(jié)腸癌組織芯片,通過(guò)構(gòu)建vsh RNA慢病毒載體抑制細(xì)胞中KPNA2的表達(dá),體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估KPNA2表達(dá)下調(diào)后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性表型的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):40例結(jié)腸癌樣品中,25例出現(xiàn)KPNA2的高表達(dá),占總例數(shù)的62%;KPNA2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高達(dá)5倍以上的例數(shù)有18例,占總數(shù)的45%,提示KPNA2作為結(jié)腸癌相關(guān)基因的可能性大;Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示,大多數(shù)結(jié)腸癌組織中KPNA2的蛋白水平高于其對(duì)應(yīng)的正常黏膜組織。組織芯片中KPNA2基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于正常腸上皮組織,并且KPNA2基因的高表達(dá)可以作為結(jié)腸癌患者預(yù)后判斷的獨(dú)立影響因素。體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),KPNA2基因的下調(diào)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和遷移能力;裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),KPNA2基因的下調(diào)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的體內(nèi)致瘤能力。本實(shí)驗(yàn)研究KPNA2基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)模式及其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為KPNA2基因在臨床診斷和治療的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。第一部分五個(gè)候選癌基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)目的:檢測(cè)5個(gè)Karyopherins家族成員KPNA2、KPNA4、KPNA5、KPNA7及KPNB1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá),以篩選該家族中與結(jié)腸癌相關(guān)的基因。方法:Real-time PCR檢測(cè)40對(duì)結(jié)腸癌組織及其配對(duì)的正常黏膜組織中5種基因的m RNA表達(dá)水平,并通過(guò)Wsetern blot分析驗(yàn)證KPNA2在配對(duì)組織樣品中的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1.40例樣品中,25例出現(xiàn)KPNA2的高表達(dá),占總例數(shù)的62%;16例出現(xiàn)KPNA4的高表達(dá),占總例數(shù)的40%;10例表現(xiàn)出KPNA5高表達(dá),占總例數(shù)的25%;KPNA7和KPNB1高表達(dá)的例數(shù)分別為13例和9例,各占總例數(shù)的32%和22%。此外,KPNA2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高達(dá)5倍以上的例數(shù)有18例,占總數(shù)的45%。2.Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示大多數(shù)結(jié)腸癌組織中KPNA2的蛋白水平高于其對(duì)應(yīng)的正常黏膜組織。結(jié)論:KPNA2基因是在結(jié)腸癌中發(fā)揮主要作用的Karyopherins家族成員,其在結(jié)腸癌組織中的m RNA水平及蛋白水平均高于正常組織。第二部分結(jié)腸癌組織芯片中KPNA2的表達(dá)及預(yù)后判斷價(jià)值的研究目的:免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)KPNA2在結(jié)腸癌組織芯片中的表達(dá),并分析其與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。方法:免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)203例結(jié)腸癌組織芯片進(jìn)行染色,統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析KPNA2的表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果:1.KPNA2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于其配對(duì)的正常黏膜組織,兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;KPNA2基因的高表達(dá)與結(jié)腸癌的AJCC分期、腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度及Ki-67的表達(dá)顯著相關(guān)。2.KPNA2基因高表達(dá)患者的5年無(wú)病生存率和總體生存率明顯低于KPNA2低表達(dá)患者;KPNA2基因的高表達(dá)可以作為結(jié)腸癌患者預(yù)后判斷的獨(dú)立影響因素。結(jié)論:KPNA2基因是結(jié)腸癌預(yù)后的獨(dú)立診斷因素,可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。第三部分KPNA2在結(jié)腸癌惡變進(jìn)程中的生物學(xué)功能研究目的:構(gòu)建KPNA2表達(dá)水平下調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞模型,以進(jìn)一步探討KPNA2基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。方法:運(yùn)用vshRNA慢病毒載體抑制細(xì)胞中KPNA2基因的表達(dá),構(gòu)建RKO和HCT116兩種KPNA2表達(dá)下調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞株;通過(guò)CCK-8、平板克隆、Transwell小室和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),研究KPNA2表達(dá)下調(diào)后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。結(jié)果:1.構(gòu)建4個(gè)RNAi慢病毒載體候選靶點(diǎn),并通過(guò)Real-time PCR和Western blot外源篩選出KPNA2-RNAi(23866-1)靶點(diǎn)對(duì)KPNA2基因敲減效率最顯著,為有效靶點(diǎn)。2.Real time PCR和Western blot驗(yàn)證由vshRNA慢病毒載體構(gòu)建的KPNA2表達(dá)下調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞中,KPNA2基因的敲減效率達(dá)70%以上,提示KPNA2表達(dá)下調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。3.體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:采用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞活性,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48、72小時(shí)后,KPNA2基因敲減細(xì)胞的活性較其對(duì)照組明顯下降;克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KPNA2基因敲減細(xì)胞的克隆形成能力較對(duì)照組明顯下降。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中,KPNA2基因敲減組穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組。4.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KPNA2基因的表達(dá)下調(diào)可以有效減弱結(jié)腸癌細(xì)胞的體內(nèi)致瘤能力。結(jié)論:KPNA2基因表達(dá)下調(diào)后結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移及裸鼠成瘤能力顯著降低。提示KPNA2基因表達(dá)下調(diào)可引起結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性程度降低。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌 KPNA2 診斷 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-14
• 中英文名詞對(duì)照14-16
• 緒論16-18
• 第一部分 五個(gè)候選癌基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)18-34
• 1.引言18
• 2.材料和方法18-26
• 3.結(jié)果26-30
• 4.討論30-34
• 第二部分 結(jié)腸癌組織芯片中KPNA2的表達(dá)及預(yù)后判斷價(jià)值的研究34-48
• 1.引言34
• 2.材料和方法34-40
• 3.結(jié)果40-46
• 4.討論46-48
• 第三部分 KPNA2在結(jié)腸癌惡變進(jìn)程中的生物學(xué)功能研究48-81
• 1.引言48
• 2.材料和方法48-66
• 3.結(jié)果66-79
• 4.討論79-81
• 全文總結(jié)81-82
• 參考文獻(xiàn)82-87
• 致謝87-89
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文情況與參研項(xiàng)目89

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7 宋e，

本文編號(hào)：1048827