【摘要】：推拿手法作為傳統(tǒng)中醫(yī)外治療法,其本質(zhì)為機械力學刺激,能產(chǎn)生如壓力、張力、摩擦力和剪應力等多種形式的“推拿力”(機械力),在機械力作用下人體組織細胞對機械刺激的反應可能是推拿細胞生物力學原理之一,如何將力學信號轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N生化信號是推拿手法機制研究的關鍵。目前,對手法生物力學原理的研究已由宏觀向微觀深入,但體內(nèi)復雜的力學環(huán)境因素使體內(nèi)研究難以區(qū)別單一效應或特定的聯(lián)合效應,基于細胞分析的體外細胞培養(yǎng)技術給這一難題的解決帶來轉(zhuǎn)機;機體內(nèi)的各種力學敏感細胞是手法機械力作用的主要部位和效應靶點;通過文獻檢索我們發(fā)現(xiàn),目前,已有研究者構(gòu)建了一些推拿手法相關的骨骼肌細胞體外培養(yǎng)-力學刺激模型,發(fā)現(xiàn)不同參數(shù)(頻率、時間、力)作用下組織細胞的部分力學響應特征,但他們之間的關系未能得到很好的闡述;我們前期工作發(fā)現(xiàn)相同手法的不同生物力學參數(shù)及其所引發(fā)的力學效應存在差異,但是因為何種因素導致這種不同生物力學參數(shù)機械力刺激下力學效應的差異?不同生物力學參數(shù)機械力刺激下細胞的生物力學效應有何異同?我們?nèi)匀徽J識較淺。目的:構(gòu)建骨骼肌細胞體外培養(yǎng)-力學刺激模型,模擬推拿機械力刺激,觀察恒定壓力作用下不同刺激時間以及固定時間不同應力模式、不同強度刺激下大鼠骨骼肌細胞(RSkMCs)生物學力響應特征,探討推拿手法效應機制。方法:體外培養(yǎng)RSkMCs,采用四點彎曲細胞力學加載系統(tǒng)(FPBS)施加類推拿機械力刺激,觀察恒定壓力作用下不同時間;及固定時間,不同應力模式、不同強度機械力作用下RSkMCs生物力學效應的變化,采用倒置生物顯微鏡觀察細胞形態(tài)及排列變化,流式細胞儀(FCM)分析細胞周期、凋亡及細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度變化,計算細胞S期細胞比例(SPF)及增殖指數(shù)(PI)的變化;免疫組織化學(IHC)檢測MyOD、Myf5蛋白表達水平的變化;酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELIS A)和硝酸還原酶法(NRM)分別檢測培養(yǎng)上清液中白介素6(IL-6)、前列腺素E_2(PGE_2)和一氧化氮(NO)濃度的變化;分析各指標之間相關性。結(jié)果:1.細胞形態(tài)及排列改變與機械力刺激時間、強度及應力模式有關,刺激時間越長、強度越大細胞形態(tài)及排列改變越明顯;壓縮性應力細胞形態(tài)趨于類圓形改變,牽張性應力細胞形態(tài)趨于梭形改變,交互應力細胞形態(tài)及排列改變不明顯。2.不同時間、應力模式及強度的機械力對細胞凋亡的影響存在差異,持續(xù)壓力作用下,細胞凋亡成一定的時間依賴性,時間越長細胞凋亡越明顯;固定刺激時間30min,不同模式的應力刺激均可以促進細胞凋亡,持續(xù)壓力促進細胞凋亡作用強于周期性作用力;輕、中強度的刺激可以抑制細胞凋亡,而重強度的刺激對細胞的凋亡作用與力學性質(zhì)有關,單一性質(zhì)壓力刺激抑制凋亡,組合交互性質(zhì)(壓縮-牽張/牽張-壓縮)刺激促進細胞凋亡。3.機械力可以通過影響SPF而影響細胞增殖,持續(xù)壓力刺激對肌細胞的SPF及PI呈雙向調(diào)節(jié)作用,短時間(90min)抑制,長時間(120min)促進;刺激時間30min,周期性牽張應力可以顯著增加SPF及PI;輕、中、強三種強度刺激均可增加SPF及PI,以輕、重刺激作用明顯。4.機械力刺激可以影響肌細胞的分泌,短時間(30min)、輕、中刺激顯著提升肌細胞培養(yǎng)上清液中PGE_2和NO濃度及胞內(nèi)Ca~(2+)濃度,重刺激胞內(nèi)Ca~(2+)濃度與力學模式有關,組合交互性質(zhì)(壓縮-牽張/牽張-壓縮)機械力提升胞內(nèi)C a~(2+)濃度,單一性質(zhì)壓力無顯著影響;力的性質(zhì)而言,周期性牽張應力可以顯著提升肌細胞培養(yǎng)上清液中PGE_2和NO濃度及胞內(nèi)Ca~(2+)濃度;持續(xù)壓力、重刺激肌細胞培養(yǎng)上清液中IL-6濃度有降低趨勢。5.MyoD、Myf5蛋白的表達與機械力刺激時間、強度、性質(zhì)有關,持續(xù)壓力作用,短時間(30min)促進MyoD、Myf5蛋白的表達,但隨著時間延長促進作用減弱;刺激時間30min,MyoD、Myf5對周期性作用力敏感;不同強度單一性質(zhì)壓力刺激對MyoD、Myf5蛋白的表達無影響,組合交互性質(zhì)(壓縮-牽張/牽張-壓縮)輕、中、強度刺激可以促進MyoD、Myf5蛋白的表達。結(jié)論:1.不同時間、應力模式及強度的機械力引發(fā)的細胞生物力學效應存在差異,細胞可以通過改變形態(tài)、周期、增殖與凋亡、分泌及蛋白的合成等力學組學形式來響應機械力刺激,通過多層次的力學-化學-生物學耦合作用產(chǎn)生生物學效應。2.細胞直接感受機械力刺激并調(diào)控生物信號的轉(zhuǎn)導可能是推拿手法發(fā)揮局部治療作用的效應機制之一。3.合理的用力模式及時間、強度是推拿手法發(fā)揮治療效應的關鍵因素。
【學位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R244.1;R-332
【圖文】：

對力學刺激的反應基本上都是以信號傳遞的方式進行著的[24]于體內(nèi)外的機械信號通過細胞與細胞之間的即時影響（如胞內(nèi)械信號轉(zhuǎn)導為一定的電化學信號兩種模式在生物體內(nèi)進行傳遞的應答和響應（如細胞變形、力敏感型離子通道的激活、力學）方式，產(chǎn)生與之相應的生物學行為改變[17,18,25]。在機械力的通過細胞層次的力學-生物學耦合（增殖、分化、凋亡及對機等）、分子層次的力學-化學耦合（蛋白質(zhì)、DNA 等生物大分學-化學-生物學耦合作用引起局部效應和整體效應，從而對機調(diào)整[19-21,25]，它涉及細胞在力學載荷作用下細胞的各種力學行與凋亡、代謝等一系列改變[26,27]，這種在機械力刺激下于細協(xié)同發(fā)生作用的過程稱為力學組學[20,21]（細胞受到的力學刺激應答，包括轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學與系統(tǒng)變化等，圖 1B）。A. B.

05個／mL，每孔加入 0.2mL 的細胞懸液體和 0.8mL 的培養(yǎng)基，將細胞接種到 24 孔板，置于 37℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng) 48h 后，每天取出 3 個孔的細胞消化后制成單細胞懸液，臺盼藍染色 3min 后顯微鏡下進行細胞計數(shù)，連續(xù) 7 日，細胞每 2 天換一次液，根據(jù)計數(shù)結(jié)果使用 GraphPad Prism 軟件繪制細胞生長曲線。3 研究結(jié)果3.1 細胞形態(tài)原代骨骼肌細胞較小，呈圓形或類圓形，折光性較強，隨著培養(yǎng)時間的延長肌細胞開始增殖，形態(tài)逐漸延展變成梭形或紡錘形，并逐漸趨于融合（圖 1-1A）。貼壁細胞呈梭形、紡錘形或多角形，折光性較好（圖 1-1B）；隨著培養(yǎng)時間延長，細胞增殖并逐漸融合形成肌管（圖 1-1C）。A.B. C.

成都中醫(yī)藥大學博士學位論文3.2 細胞鑒定α-骨骼肌肌動蛋白(α-Sarcometric Actin，α-SCA) 是骨骼肌特有的結(jié)構(gòu)和功能蛋白[68]，通過對α-SCA免疫細胞化學染色可以與其它細胞鑒別。本實驗采用α-SCA單克隆抗體進行細胞免疫熒光染色，結(jié)果顯示 90%以上的細胞呈陽性（即肌細胞純度達 90%以上）胞漿染成紅色（圖 1-2A和B），細胞核為藍色（圖 1-2C），其他非骨骼肌細胞呈陰性；說明所培養(yǎng)的細胞為骨骼肌細胞。A. B.C.

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本文編號：2790613