目的基于肝纖維化時血管新生的病理機制,以肝纖維化不同時期的肝竇內(nèi)皮細胞(SEC)與VEGF過表達的肝星狀細胞(HSC)共培養(yǎng)為實驗材料,探討疏肝健脾方含藥血清對VEGF調(diào)控的抗肝纖維化機制,并確定該方的最佳干預時相。方法1.分離正常大鼠HSC及SEC,大鼠皮下注射CCl4制備肝纖維化模型,分別于造模的第2w、4w、8w分離模型大鼠SEC;2.針對大鼠VEGF基因構建sh RNA重組慢病毒,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HSC,共聚焦顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染后HSC綠色熒光蛋白表達、免疫印跡蛋白(Western Blot)檢測VEGF蛋白表達;3.中濃度疏肝健脾活血方行大鼠灌胃制備含藥血清,得到含藥血清后配置為不同濃度的含藥血清培養(yǎng)基作用于HSC,MTT法檢測不同濃度的疏肝健脾活血方含藥血清對HSC增殖的影響,確定含藥血清最佳有效濃度;4.分別取2w、4w、8w三個時間點分離得到的正常大鼠HSC和SEC、肝纖維化模型大鼠SEC、轉(zhuǎn)染得到的VEGF過表達HSC分為如下6組:H組:正常大鼠HSC完全培養(yǎng)基培養(yǎng);HS組:正常大鼠HSC和正常大鼠SEC完全培養(yǎng)基共培養(yǎng);HM組:正常大鼠HSC和模型大鼠SEC完全培養(yǎng)基共培...

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 大鼠HSC及SEC原代分離實驗研究
    一、材料與方法
        (一)實驗材料
            1.實驗動物
            2.主要實驗試劑
            3.主要儀器設備
            4.主要試劑配制
        (二)實驗方法
            1.模型制備
            2.HSC及SEC分離
            3.臺盼藍計數(shù)及免疫熒光鑒定
    二、結果
        (一)光鏡下觀察結果
        (二)臺盼藍計數(shù)結果
        (三)免疫熒光鑒定結果
第二部分 shRNA重組慢病毒感染大鼠HSC過表達VEGF實驗研究
    一、材料與方法
        (一)實驗材料
            1.實驗細胞
            2.主要實驗試劑
            3.主要儀器設備
        (二)實驗方法
            1.慢病毒載體的構建
            2.病毒包裝
            3.病毒感染HSC
            4.嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞
            5.指標檢測
            6.統(tǒng)計方法
    二、結果
        (一)慢病毒PCR測序結果
        (二)熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后HSC細胞綠色熒光蛋白的表達變化
        (三)轉(zhuǎn)染后VEGF相對表達量
第三部分 VEGF/VEGFR在HSC/SEC共培養(yǎng)體系中的表達及疏肝健脾活血方的干預作用
    一、材料與方法
        (一)實驗材料
            1.實驗動物及實驗細胞
            2.實驗藥材
            3.主要實驗試劑
            4.主要儀器設備
            5.PCR引物和擴增片段長度如下
        (二)實驗方法
            1.含藥血清制備
            2.MTT法確定最佳含藥血清濃度
            3.細胞分組及干預
            4.指標檢測
            5.統(tǒng)計學方法
    二、結果
        (一)最佳含藥血清的濃度確定
        (二)各組HSC活力及增值率
        (三)各組SEC中CD31、vWF蛋白相對表達量比較
        (四)各組中HSC的膠原Ⅳ、VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達量比較
        (五)各組中HSC的VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2mRNA相對表達結果
    三、分析與討論
        (一)VEGF在血管新生中起重要作用
        (二)VEGF在肝纖維化發(fā)展中促進病理性血管新生
            1.SEC與肝竇毛細血管化
            2.VEGF加重肝竇毛細血管化促進肝纖維化發(fā)展
            3.VEGF促進血管網(wǎng)絡形成加重血液分流
            4.VEGF增加血管通透性并加重炎癥反應
        (三)中醫(yī)學對肝纖維化中病理性血管新生的認識
            1.病名的認識
            2.病因病機
            3.中醫(yī)治則治法
            4.疏肝健脾活血方的組方及功效
        (四)實驗結果分析
            1.SEC失窗孔后加重肝纖維化
            2.VEGF在肝纖維早期即促進肝竇毛細血管化的發(fā)展
            3.疏肝健脾活血方對肝纖維化時病理性血管新生干預的作用機制
結論
參考文獻
附圖
致謝
文獻綜述
    參考文獻



本文編號：3759759