發(fā)布時間：2021-08-31 23:20

　　目的基于蛋白質、肽類物質組成及修飾組成的變化,研究砂炒炮制對穿山甲物質基礎的影響。方法采用Nano LC-MS/MS對炮制前后穿山甲蛋白質、肽類組成及變化進行分析鑒定,對鑒定的蛋白質、肽類發(fā)生的脫酰胺修飾與氧化修飾進行比較。結果穿山甲主要由角蛋白、連接蛋白、橋粒蛋白等結構蛋白及促進角質致密結構形成的異構酶類組成。穿山甲經(jīng)炮制后,可溶性蛋白質、肽類的鑒定數(shù)量未見明顯變化,難溶性蛋白質鑒定數(shù)量顯著降低;炮制后蛋白質、肽類的脫酰胺修飾數(shù)量顯著增加;炮制后I型、II型角蛋白的鑒定肽段數(shù)量顯著增加,Asn與Gln發(fā)生脫酰胺修飾的數(shù)量顯著增加;穿山甲炮制前后鑒定肽段的相對分子質量分布及親疏水性無顯著變化。結論盡管炮制會降低穿山甲整體蛋白質鑒定的數(shù)量,但可顯著增加角蛋白的鑒定肽段數(shù)量,可顯著提高蛋白質、肽類成分的脫酰胺修飾數(shù)量。結果提示炮制過程有利于角蛋白等結構蛋白的蛋白質、肽類成分的溶出與釋放。為穿山甲物質基礎研究,炮制對角質類動物藥物質基礎的影響研究等提供依據(jù),也為穿山甲替代資源尋找與評價提供研究思路與方法。 

【文章來源】：中草藥. 2020,51(13)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

穿山甲中鑒定的蛋白質、肽段韋恩圖

穿山甲主要含有角質類成分，提取方法參照前期研究[12]，稍作改動。提取流程如圖1所示，取穿山甲樣品（MS-1～MS-3）、炮山甲樣品（PMS-1～PMS-3）各10 mg，每個樣品加入1 mL提取液（含4%SDS,20 mmol/L DTT的Tris緩沖液），在65℃水浴孵育過夜，10 000 r/min離心10 min，取上清液為穿山甲提取液，沉淀部分重復上述提取步驟2次，將3次提取液合并，分別為穿山甲提取液（MSs-1～MSs-3）與炮山甲提取液（PMSs-1～PMSs-3），沉淀部分用PBS反復洗滌3次，分別為穿山甲渣（MSp-1～MSp-3）與炮山甲渣（PMSp-1～PMSp-3）。測定穿山甲提取液樣品（MSs-1～MSs-3、PMSs-1～PMSs-3）蛋白質量濃度，每個樣品中取200μg蛋白質總量的提取液，分別加入3倍體積的丙酮，至于-20℃靜置4 h后，10 000 r/min離心10min，棄去上清，用丙酮洗滌1次，揮干丙酮。加入200μL裂解液（含8 mol/L尿素的Tris緩沖液，pH 8）充分溶解蛋白后，加入pH 8的Tris緩沖液1 400μL稀釋，按質量百分比加入1%胰蛋白酶，置于37℃水浴孵育過夜；穿山甲渣樣品（MSp-1～MSp-3、PMSp-1～PMSp-3）用pH 8的Tris緩沖液混懸，扣除提取液中蛋白質總量后，按質量百分比加入1%胰蛋白酶，置于37℃水浴孵育過夜。穿山甲提取液酶解樣品與穿山甲渣酶解樣品脫鹽，干燥，純水復溶后測定多肽總量，取20μg多肽溶液，再次干燥后用初始流動相復溶至多肽質量濃度為1μg/μL，待進樣。

以I型角蛋白炮制前后的變化為例說明脫酰胺位點、肽段數(shù)量、PSM及肽段序列的差異。如圖3所示，紫色箭頭表示炮制后的I型角蛋白較炮制前新出現(xiàn)的脫酰胺修飾位點，包括Gln75、Asn80、Asn101、Gln178、Gln203與Gln336。以胰蛋白酶酶切后形成的肽段GDLERQNQEYQVLLDVR為例，在炮制前的樣品中，僅測到GDLERQNQEYQVLLD VR與GDLERQNQEYQ(+0.98)VLLDVR 2條肽段；而炮制后的樣品中，測到了序列相同但是含有不同脫酰胺修飾的肽段共7個，除了炮制前檢測到的肽段GDLERQNQEYQVLLDVR與GDLERQNQEYQ(+0.98)VLLDVR外，還包括GDLERQN(+0.98)QE YQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)NQEYQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)N(+0.98)QEYQVLLDVR、GDLER Q(+0.98)NQ(+0.98)EYQVLLDVR與GDLERQ(+0.98)NQEYQ(+0.98)VLLDVR，分別在Gln334、Asn335、Gln336及Gln339發(fā)生了不同組合的脫酰胺修飾。如圖3-C所示，比較MS/MS圖譜可以看出，根據(jù)b離子或y離子的偏差，可準確計算出脫酰胺修飾的位點，序列GDLERQNQEYQVLLDVR的b5+、b6+、b7+、b8+、b9+分別為571.29、699.34、813.39、941.44、1 070.49；而序列GDLERQ(+0.98)NQ(+0.98)EYQVLLDVR的b5+、b6+、b7+、b8+、b9+分別為571.29、700.33、814.37、943.41、1 072.46，兩者（b6+-b5+）值分別為128.05與129.04，表明肽段的6位Gln發(fā)生了修飾，兩者（b7+-b6+）值相同，表明7位Asn未發(fā)生修飾，（b8+-b7+）值分別為128.05與129.04，則表明8位Gln也發(fā)生了修飾，從而明確脫酰胺修飾的位點。圖3結果表明炮制后角蛋白修飾數(shù)量顯著增加，相同氨基酸序列上發(fā)生不同位點修飾使得肽段鑒定數(shù)量也明顯增加。2.6 穿山甲肽段相對分子質量與親疏水性分布的對比分析

【參考文獻】：
期刊論文
[1]HPLC法同時測定穿山甲炮制品中3個主要環(huán)二肽成分的含量[J]. 劉遜,龐博文,王亞瓊,汪明志,吳芝遠,劉陽,張華鋒.  藥物分析雜志. 2019(08)
[2]不同炮制火候對砂炒穿山甲性狀和環(huán)二肽類成分的影響[J]. 劉遜,汪明志,吳芝園,龐博文,張華鋒,王亞瓊.  中藥材. 2019(04)
[3]穿山甲高溫砂炒炮制增效機制研究[J]. 劉遜,劉睿,趙呈雷,吳芝園,朱曄,談如藍,劉競天,張迪.  中草藥. 2019(07)
[4]基于轉錄組學-蛋白質組學-多肽組學整合關聯(lián)分析策略的動物藥蛋白多肽類成分研究思路及方法[J]. 楊彬,高文遠,張艷軍.  中草藥. 2019(05)
[5]中藥穿山甲的DNA分子鑒定研究[J]. 尹艷,劉遜,王兵,高琳惠,張夏楠.  中國中藥雜志. 2017(11)
[6]4種不同基原穿山甲炮制品的鑒定[J]. 劉遜,張華峰,劉雪梅,朱纓,崔小兵.  中藥材. 2017(03)
[7]四種穿山甲屬動物的生藥學研究[J]. 吳芝園,巢建國,劉遜.  現(xiàn)代中藥研究與實踐. 2015(02)
[8]穿山甲應用及炮制研究進展[J]. 王妍,張國民,哈偉.  中國現(xiàn)代中藥. 2015(03)
[9]角蛋白的分子構成、提取及應用[J]. 賈如琰,何玉鳳,王榮民,李芳蓉,王艷.  化學通報. 2008(04)



本文編號：3375801