阿膠是一味傳統(tǒng)中藥,在中國具有2000多年食用歷史。阿膠一直被公認(rèn)為治病圣藥,曾被李時(shí)珍記入本草綱目譽(yù)為補(bǔ)血圣藥。阿膠主要由黑驢皮熬制而成,它的基本成分為膠原蛋白的降解產(chǎn)物。阿膠止血補(bǔ)血促進(jìn)造血的功能已被廣泛接受。然而,阿膠對(duì)細(xì)胞,動(dòng)物模型,人體免疫系統(tǒng)的藥理學(xué)機(jī)制沒有被報(bào)道過。我們都知道,在正常生理?xiàng)l件下,體內(nèi)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞再生處于平衡狀態(tài),然而當(dāng)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常時(shí),疾病就會(huì)伴隨發(fā)生。目前無論是細(xì)胞凋亡或是氧化應(yīng)激在臨床很多重大疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著極為重要的角色。例如敗血癥,它是由細(xì)菌等多種病原微生物感染引起的多器官功能性障礙疾病。目前臨床上對(duì)敗血癥的治療主要依賴抗生素及其他輔助治療措施,而這些手段往往因抗藥性和抗生素毒性及疾病復(fù)雜性等不能發(fā)揮很好的治療效果。敗血癥患者的免疫系統(tǒng)易發(fā)生氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡;因此,本課題主要研究阿膠是否可以促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)物,小鼠敗血癥模型及人外周血單核細(xì)胞中氧化應(yīng)激的抗性,進(jìn)而將阿膠用于臨床常見病的治療。首先,我們發(fā)現(xiàn)阿膠對(duì)體外培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞無毒副作用;在無血清饑餓處理?xiàng)l件下,阿膠能促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞的分裂繁殖能力。其次,在氧化應(yīng)激壓力下,阿膠對(duì)RAW264.7細(xì)胞具有抗凋亡作用。為證明阿膠保護(hù)作用的普遍性,選擇其他免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)阿膠這種保護(hù)作用具有免疫細(xì)胞特異性。蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果表明阿膠能顯著降低Caspase-3和PARP1(Cas3的底物)等凋亡蛋白的表達(dá)量。此外,阿膠不僅能降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平同時(shí)也能改善線粒體膜功能。在百草枯誘導(dǎo)果蠅氧化應(yīng)激模型中,我們?cè)俅巫C明了阿膠的直接抗氧化應(yīng)激作用。在體內(nèi)為進(jìn)一步驗(yàn)證阿膠的抗凋亡作用,我們通過腹腔注射LPS建立小鼠敗血癥模型。通過DNA ladder實(shí)驗(yàn)和TUNEL染色我們發(fā)現(xiàn)阿膠能顯著降低敗血癥小鼠免疫器官(胸腺和脾臟)細(xì)胞凋亡的數(shù)量。通過對(duì)血清中炎癥因子的ELISA檢測(cè)表明,在敗血癥早期阿膠能顯著提高抗炎性細(xì)胞因子IL-10的水平,使敗血癥小鼠積極抵抗炎癥反應(yīng)進(jìn)一步降低促炎性細(xì)胞因子IL-1β;IL-6;TNF-α;HMGB1的水平,從而提高敗血癥小鼠的幸存率。最后,由于雙氧水刺激會(huì)造成人免疫細(xì)胞快速死亡,所以采用Etoposide、Staurosporine、LPSplusNigericin進(jìn)行凋亡的誘導(dǎo)進(jìn)而檢測(cè)阿膠對(duì)人免疫細(xì)胞(THP1cell和PBMCcell)的保護(hù)作用。通過Caspase3/7活性檢測(cè),ATP檢測(cè)及凋亡蛋白PARP1的斷裂情況檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)阿膠對(duì)人免疫細(xì)胞仍然具有抗凋亡的作用效果,且這種保護(hù)作用不隨凋亡誘導(dǎo)劑的變化而改變。敗血癥引起的細(xì)胞凋亡會(huì)通過不同方式影響宿主的免疫功能,例如免疫器官和免疫細(xì)胞的凋亡、免疫抑制、細(xì)胞因子大量表達(dá)等。此外,氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞凋亡在衰老及輻射損傷誘導(dǎo)疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要作用。因此,阿膠作為一種免疫保護(hù)劑有望成為能應(yīng)用于臨床的抗凋亡藥物,進(jìn)而治療多種由細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激引起的疾病。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

伴隨著細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生［２０－２３］。對(duì)于高等脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中，指間適??量的細(xì)胞凋亡扮演著十分重要的作用。此過程的細(xì)胞凋亡可以將手指彼此分開進(jìn)而??增加手的靈便性和抓握能力（圖１．３Ａ）。當(dāng)生物體在發(fā)育過程中為去除不再需要的??組織細(xì)胞時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞進(jìn)行可控的程序性死亡過程［２４］。如蝌蚪尾巴變態(tài)發(fā)??育過程；哺乳類雄性動(dòng)物乳房器官的發(fā)育；果蠅發(fā)育過程中唾液腺的消失等（圖??１．３Ｂ）。多細(xì)胞生物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中往往會(huì)產(chǎn)生過多的細(xì)胞，山十機(jī)體內(nèi)細(xì)胞再??生和死亡處于平衡狀態(tài)，所以當(dāng)細(xì)胞生產(chǎn)過量時(shí)就會(huì)發(fā)生細(xì)胞程序性死亡［２５］（閹??１．３Ｃｈ然而此過程一旦發(fā)生異常可能伴隨著腫瘤的發(fā)生，所以機(jī)體進(jìn)行止常的細(xì)??胞程序性死亡是必要。當(dāng)生物體受到外界不良環(huán)境的影響時(shí)，如輻射、紫外線、致??癌致畸等有害物質(zhì)刺激時(shí)就會(huì)對(duì)受損細(xì)胞啟動(dòng)程序性死亡。除此以外，Ａ機(jī)體受到??細(xì)菌等多種病原微生物的感染時(shí)，免疫系統(tǒng)就會(huì)對(duì)病原微生物進(jìn)行杵噬和清楚，Ａ??些免疫細(xì)胞存在過度免疫時(shí)機(jī)體也會(huì)對(duì)這部分細(xì)胞進(jìn)行程序性死亡伯兮的激活。??這是竹椎動(dòng)物對(duì)自身免疫調(diào)控的一種重要保護(hù)措施。??細(xì)胞死亡在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用??機(jī)體內(nèi)細(xì)胞死亡和細(xì)胞再生維持著動(dòng)態(tài)平衡

圖１．４細(xì)胞不同的死亡方式（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ?ａｎｄ?Ｓｔｒａｓｓｅｒ，２００９）??Ｆｉｇ?１．４?Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｅｌｌ?ｄｅａｔｈ?ｍｅｔｈｏｄｓ．?（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ?ａｎｄ?Ｓｔｒａｓｓｅｒ，２００９）??隨后細(xì)胞核膜下的核纖層逐漸分解，核內(nèi)染色質(zhì)固縮成不均一的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)（圖１．４），??其主要原因是核酸內(nèi)切酶切斷了核小體間連接的ＤＮＡ，最終產(chǎn)生寡聚核小體片段，??其片段大小為１２０？１８０ｂｐ。ＤＮＡｌａｄｄｅｒ檢測(cè)時(shí)條帶呈梯狀分布。隨著細(xì)胞核的改變，??相鄰細(xì)胞間連接復(fù)合體消失；但此時(shí)，細(xì)胞膜的形狀仍保持完整，但細(xì)胞器（如高??爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）出現(xiàn)泡狀結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜融合并形成凋亡小體，其次核被膜也會(huì)膨??大等［３３，?３６］；形成的凋亡小體以出泡的形式離開正在死亡的細(xì)胞。凋亡小體很快就??會(huì)被周圍鄰近的巨噬細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞吞噬，而不會(huì)引起周圍組織的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞??發(fā)生凋亡時(shí)其自身的生化反應(yīng)也會(huì)發(fā)生改變。首先是鈣離子和蛋白激酶的改變：細(xì)??１４??

Ｃａｓｐａｓｅ－８單體以活性較弱的酶原形式存在，當(dāng)被Ｆａｓ受體胞漿內(nèi)側(cè)的ＦＡＤＤ死亡??結(jié)構(gòu)域招募后，在胞漿局部達(dá)到一定的濃度后誘導(dǎo)自身激活從而激活細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)??通路。此外，ＦＡＤＤ也能通過Ｃａｓｐａｓｅ－８直接活化Ｃａｓｐａｓｅ－３?（圖１．７）。??內(nèi)源性凋亡途徑：也稱為線粒體途徑或應(yīng)激性凋亡途徑，該途徑是通過激活??１６??
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