靈菌紅素(Prodigiosin)是一類天然紅色色素的總稱,具有抗菌、抗瘧原蟲、免疫抑制和抗腫瘤等生物活性。美國國立癌癥研究所(NSI)報道,靈菌紅素對57種人源性腫瘤細胞具有抗性,但對正常細胞不具明顯的毒性,說明靈菌紅素具有成為抗腫瘤藥物的潛力。粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)是靈菌紅素主要產生菌,假單胞菌和放線菌等微生物也具有產生靈菌紅素能力。我們課題組從中藥蜚蠊腸道中分離得到4株粘質沙雷氏菌,其中菌株WA12-1-18具有穩(wěn)定產生紅色色素的能力,經鑒定該紅色色素為靈菌紅素。在此基礎上,采用體外細胞實驗和體內荷瘤裸鼠動物實驗初步研究靈菌紅素的抗腫瘤活性。1、研究目的評價蜚蠊腸道粘質沙雷氏菌次生代謝物靈菌紅素的抗腫瘤活性,并初步探討其抗腫瘤作用機制,為靈菌紅素開發(fā)成新一代抗腫瘤藥物奠定理論條件。2、研究方法(1)蜚蠊腸道內生粘質沙雷氏菌WA12-1-18的形態(tài)和分子鑒定光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察菌株WA12-1-18的形態(tài)特征,16S rDNA、BLAST同源性比對、MEGA軟件構建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹等方法對菌株進行分子生物學分類與鑒定。(2)靈菌紅素制備與鑒定采用固體發(fā)酵法對粘質沙雷氏菌WA12-1-18進行發(fā)酵,經硅膠柱層析等技術分離純化得到紅色色素單體后,采用高效液相(HPLC)、紫外(UV)、紅外(IR)、液質聯(lián)用(LC-MS)和核磁共振(NMR)等技術鑒定該化合物結構。(3)靈菌紅素體外抗腫瘤作用以宮頸癌細胞Hela、鼻咽癌細胞CNE-2、耐紫杉醇肺癌細胞A549T、耐阿霉素乳腺癌細胞MCF-7/ADR為實驗對象,通過MTT法、流式細胞術、熒光染色、電子顯微鏡、Westernblot和qRT-PCR法等技術檢測靈菌紅素的體外抗腫瘤活性。(4)靈菌紅素體內抗腫瘤作用通過體內Hela荷瘤裸鼠實驗,初步評價靈菌紅素體內抗腫瘤作用及其對心、肝、脾、腎等主要生命臟器的影響。3、研究結果(1)蜚蠊腸道內生粘質沙雷氏菌WA12-1-18的分離與鑒定從蜚蠊腸道分離得到的紅色菌株WA12-1-18經形態(tài)學鑒定為革蘭氏陰性紅色短桿菌,經分子生物學鑒定,與來源于土壤的粘質沙雷氏菌相似度為99.58%,初步鑒定WA12-1-18是粘質沙雷氏菌。(2)靈菌紅素制備與鑒定分離純化后得到紅色粉末,產量達到2.77 g/L。經高效液相、紫外、紅外、液質聯(lián)用以及核磁共振鑒定該產物為靈菌紅素。穩(wěn)定性實驗結果表明:靈菌紅素宜在酸性、暗處、溫度不超過60℃的條件下儲存,另外靈菌紅素對個別金屬離子容易發(fā)生螯合作用。(3)靈菌紅素體外抗腫瘤作用靈菌紅素對宮頸癌Hela、鼻咽癌CNE-2、耐紫杉醇肺癌A549T、耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR的生長具有抑制作用,并可改變各腫瘤細胞生長周期的分布和誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡,作用效果與作用時間和藥物濃度呈依賴關系。掃描電鏡和透射電鏡結果表明,靈菌紅素能使Hela、CNE-2細胞膜表面坍塌皺縮以及尾足消失,細胞內部產生空泡結構,核邊集化,并產生部分凋亡小體。Westernblot以及qRT-PCR結果表明,靈菌紅素可以抑制Hela細胞抑凋亡基因Bcl-2以及促進促凋亡基因Bax的活化,引起caspase-3的活化,最終導致腫瘤凋亡。(4)靈菌紅素體內抗腫瘤作用靈菌紅素可以有效地抑制宮頸癌荷瘤裸鼠的瘤體生長,抑制率達到20.6%。瘤體病理組織HE結果顯示,靈菌紅素治療組腫瘤細胞稀疏,核小且染色淺,部分核固縮。免疫組化結果表明,靈菌紅素可抑制抑凋亡基因Bcl-2和促進促凋亡基因Bax的表達。另外,靈菌紅素對裸鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃等主要生命臟器均無不良影響。4、研究結論蜚蠊腸道內生粘質沙雷氏菌WA12-1-18具有穩(wěn)定產生靈菌紅素的生物特性,體外細胞和荷瘤裸鼠動物實驗均發(fā)現(xiàn)靈菌紅素具有抗腫瘤活性。為靈菌紅素的臨床應用奠定了理論基礎。
【學位單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

廣東藥科大學碩士研究生畢業(yè)論文 粘質沙雷氏菌 WA12-1-18 形態(tài)學鑒定菌株 WA12-1-18 在 LB 固體培養(yǎng)基上 28 ℃培養(yǎng) 3 天后，光學顯微鏡表面光滑，呈球狀凸起，具粘稠，顏色為鮮紅色（圖 2-1A）；經革發(fā)現(xiàn)菌體被染成紅色（圖 2-1B），提示菌株 WA12-1-18 為革蘭氏陰電鏡結果顯示，菌株 WA12-1-18 菌體呈短桿狀，兩端稍圓，無芽孢（圖

圖 2-2 菌株 WA12-1-18 的 PCR 擴增產物凝膠電泳檢測以及 16S rDNA 序列②菌株 WA12-1-18 系統(tǒng)發(fā)育樹分析將菌株 WA12-1-18 的測序結果同 GenBan 數據庫中的相似菌株進行 16rDNA 比對，結果見圖 2-3，采用 DNAman6.0 進一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株 WA12-1-與粘質沙雷氏菌相識度高達 99.58%。通過 Mega5.1 軟件，采用最大似值法構建菌株 WA12-1-18 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 2-4），結果表明菌株 WA12-1-18 為粘質沙雷菌屬。

圖 2-2 菌株 WA12-1-18 的 PCR 擴增產物凝膠電泳檢測以及 16S rDNA 序列②菌株 WA12-1-18 系統(tǒng)發(fā)育樹分析將菌株 WA12-1-18 的測序結果同 GenBan 數據庫中的相似菌株進行 16SrDNA 比對，結果見圖 2-3，采用 DNAman6.0 進一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株 WA12-1-18與粘質沙雷氏菌相識度高達 99.58%。通過 Mega5.1 軟件，采用最大似值法構建菌株 WA12-1-18 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 2-4），結果表明菌株 WA12-1-18 為粘質沙雷氏菌屬。
【參考文獻】

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本文編號：2893806