目的探究長期服用寒痹停片及制馬錢子粉是否會引起馬錢子堿與士的寧在正常大鼠及佐劑關節(jié)炎大鼠體內的蓄積,及寒痹停片復方配伍對馬錢子粉中的馬錢子堿與士的寧的藥動學是否存在影響,同時測定大鼠肝臟CYP450酶的含量,以初步探討寒痹停片復方制劑及制馬錢子粉對大鼠代謝的影響,為寒痹停片的臨床安全、合理用藥提供科學依據。方法1.寒痹停片中馬錢子堿與士的寧在健康大鼠體內多次給藥的藥動學研究。Wistar大鼠24只,雌雄各半,分為空白對照組、寒痹停片組和制馬錢子粉組,每組8只,給藥組根據臨床上寒痹停片成人單次口服劑量及人與動物間的等效劑量換算,分別按寒痹停片0.1386g·kg~(-1)、制馬錢子粉6.93mg·kg~(-1)(按士的寧計為1.1mg·kg~(-1))的劑量灌胃給藥,每天給藥3次,連續(xù)灌胃7天。自第3天開始,每天于第二次灌胃給藥后300min眼眶靜脈采血,第7天早上灌胃給藥后5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、420、540、720min眼眶靜脈取血,采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS法測定大鼠各時間點血漿中馬錢子堿與士的寧的血藥濃度,DAS3.0軟件計算馬錢子堿與士的寧的藥動學參數,利用SPSS22.0軟件對所得的主要藥動學參數進行統(tǒng)計分析。2.寒痹停片中馬錢子堿與士的寧在佐劑大鼠體內多次給藥的藥動學研究。(1)造模隨機取Wistar雄性大鼠50只,在其右后足跖部注射弗氏完全佐劑0.1mL致炎,于致炎前及致炎后第1、3、5、7、9、11、13、15天測定大鼠左右足跖部體積,觀察大鼠關節(jié)紅腫程度及毛色變化,計算足跖腫脹率、關節(jié)炎指數,初步判斷造模是否成功。于第15天經眼眶靜脈取血后,離心,取血清,經ELISA法測定血清中IL-1β、TNF-α含量,再次驗證造模是否成功。(2)分組將造模成功的大鼠隨機分為模型對照組、寒痹停片臨床劑量組、寒痹停片高劑量組、制馬錢子粉臨床劑量組、制馬錢子粉高劑量組,每組8只。(3)給藥與取血臨床劑量組按寒痹停片0.1386g·kg~(-1)、制馬錢子粉6.93mg·kg~(-1)(按士的寧計為1.1mg·kg~(-1))的劑量灌胃給藥,高劑量組按寒痹停片1.0452g·kg~(-1)、制馬錢子粉0.1534g·kg~(-1)(按士的寧計為12mg·kg~(-1))的劑量灌胃給藥,每天給藥3次,連續(xù)灌胃7天。自第3天開始,每天于第二次灌胃給藥后300min眼眶靜脈采血,第7天早上灌胃給藥后5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、420、540、720min眼眶靜脈取血。(4)血藥濃度測定及數據處理采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS法測定大鼠各時間點血漿中馬錢子堿與士的寧的血藥濃度,DAS3.0軟件計算馬錢子堿與士的寧的藥動學參數,利用SPSS22.0軟件對所得的主要藥動學參數進行統(tǒng)計分析。3.寒痹停片及制馬錢子粉對大鼠肝臟CYP450酶的影響。取上述1、2部分灌胃給藥后第8天的大鼠,稱重后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,剖開腹腔,迅速取出肝臟,放于冰冷的生理鹽水中沖洗干凈,濾紙吸干水分,稱重,計算各組大鼠的肝臟指數。再將肝臟剪碎,用pH7.5的TMS緩沖液制成20%(w/v)的勻漿,再用低溫高速離心機(10~4×g)離心15min,取上清液加入88mmol·L~(-1)的氯化鈣溶液,使其終濃度為8mmol·L~(-1),稍攪拌混合,放冰浴5min,高速離心機27000×g離心15min,取沉淀重懸于TMS緩沖液中,用ELISA試劑盒測定肝微粒體在450nm波長下的吸光度,通過標準曲線計算大鼠肝臟中CYP450酶的濃度。結果1.寒痹停片中馬錢子堿與士的寧在正常大鼠體內多次給藥的藥動學研究。寒痹停片及制馬錢子粉中馬錢子堿與士的寧在大鼠給藥3天后血藥濃度達到穩(wěn)態(tài)。末次給藥后,寒痹停片中馬錢子堿和士的寧的主要藥動學參數分別為:T_(1/2)為4.56、3.32h,T_(max)為0.43、1.57h,T_(1/2Ka)為1.17、3.05h,Ka為11.54、3.70h~(-1),C_(max)為6.04、38.17ng·L~(-1),AUC_(0→t)為23.17、534.33ng·h·L~(-1),CL/F為25038.89、6226.80L·h~(-1)·kg~(-1);制馬錢子粉中馬錢子堿和士的寧的主要藥動學參數分別為:T_(1/2)為5.87、3.73h,T_(max)為0.66、1.04h,T_(1/2Ka)為4.57、9.88h,Ka為3.31、2.59h~(-1),C_(max)為1.31、22.07ng·L~(-1),AUC_(0→t)為45.43、376.63ng·h·L~(-1),CL/F為61028.54、16162.44L·h~(-1)·kg~(-1)。經SPSS統(tǒng)計軟件分析,與制馬錢子粉相比,寒痹停片中馬錢子堿的清除率顯著降低。2.寒痹停片中馬錢子堿與士的寧在佐劑大鼠體內多次給藥的藥動學研究。寒痹停片及制馬錢子粉的臨床劑量和高劑量組,馬錢子堿與士的寧在大鼠給藥3天后血藥濃度均達到穩(wěn)態(tài)。末次給藥后寒痹停片臨床劑量組中馬錢子堿與士的寧的主要藥動學參數為:T_(1/2)為2.23、3.35h,T_(max)為0.23、1.25h,T_(1/2Ka)為1.73、2.30h,Ka為0.44、0.37h~(-1),C_(max)為44.64、324.92ng·L~(-1),AUC_(0→t)為490.6、6336.5ng·h·L~(-1),CL/F為113456、13026L·h~(-1)·kg~(-1);制馬錢子粉臨床劑量組中馬錢子堿與士的寧的主要藥動學參數為:T_(1/2)為2.34、2.64h,T_(max)為0.56、0.56h,T_(1/2Ka)為1.50、1.89h,Ka為0.60、0.46h~(-1),C_(max)為17.38、165.89ng·L~(-1),AUC_(0→t)為190.1、2035.1ng·h·L~(-1),CL/F為313853、104873L·h~(-1)·kg~(-1);寒痹停片高劑量組中馬錢子堿與士的寧的主要藥動學參數為:T_(1/2)為3.09、2.96h,T_(max)為0.95、0.87h,T_(1/2Ka)為1.06、1.22h,Ka為0.86、0.66h~(-1),C_(max)為232.97、626.74ng·L~(-1),AUC_(0→t)為1826.6、4382.5ng·h·L~(-1),CL/F為3786738、2156109L·h~(-1)·kg~(-1);制馬錢子粉高劑量組中馬錢子堿與士的寧的主要藥動學參數為:T_(1/2)為1.14、1.67h,T_(max)為0.37、0.54h,T_(1/2Ka)為0.74、0.91h,Ka為1.13、0.84h~(-1),C_(max)為124.36、532.51ng·L~(-1),AUC_(0→t)為659.9、3437.3ng·h·L~(-1),CL/F為1893384、267919L·h~(-1)·kg~(-1)。經SPSS統(tǒng)計軟件分析,以制馬錢子粉為參照,臨床劑量組中寒痹停片中馬錢子堿的C_(max)極顯著增加;高劑量組中寒痹停片中馬錢子堿的T_(1/2)、T_(max)極顯著延長,AUC_(0→t)顯著增加,士的寧的T_(1/2)顯著延長。3.在臨床給藥劑量下,佐劑大鼠與健康大鼠相比,寒痹停片和制馬錢子粉中馬錢子堿的T_(1/2)是健康大鼠的0.49、0.40倍,CL/F是4.53、5.14倍,AUC_(0→t)是21.17、4.18倍,Ka是0.04、0.18倍,T_(1/2Ka)是1.48、0.33倍,T_(max)是0.53、0.85倍,C_(max)是7.39、13.27倍;士的寧的T_(1/2)是健康大鼠的1.01、0.71倍,CL/F是2.09、6.49倍,AUC_(0→t)是11.86、5.40倍,Ka是0.1、0.18倍,T_(1/2Ka)是0.75、0.19倍,T_(max)是0.80、0.54倍,C_(max)是8.51、7.52倍。經統(tǒng)計學軟件分析,寒痹停片中馬錢子堿的T_(1/2)、Ka、T_(max)與健康大鼠相比顯著降低,兩種藥物中的馬錢子堿與士的寧的C_(max)與AUC_(0→t)極顯著增加,CL/F顯著加快。4.寒痹停片及制馬錢子粉對大鼠肝臟CYP450酶的影響。健康大鼠:大鼠灌胃給予寒痹停片與制馬錢子粉后,肝指數分別為3.67、3.61,空白對照組為3.35;肝臟CYP450酶含量分別為0.1720、0.1558ng·ml~(-1),空白對照組為0.1438ng·ml~(-1)。其中,與空白對照組相比,寒痹停片與制馬錢子粉組肝指數顯著增加,肝臟CYP450酶含量雖也有所增加,但差異無顯著性。而寒痹停片組與制馬錢子粉組間肝指數與肝CYP450酶含量均無顯著性差異。佐劑性大鼠:臨床劑量下,寒痹停片與制馬錢子粉的肝指數分別為3.15、3.14,模型對照組為3.11;肝臟CYP450酶含量分別為0.1533、0.1567,模型對照組為0.1480。高劑量下,寒痹停片與制馬錢子粉的肝指數分別為3.40、3.39;肝臟CYP450酶含量分別為0.1679、0.1581。與模型對照組相比,寒痹停片與制馬錢子粉在兩種劑量下肝指數均有所增加,但高劑量增加幅度更大,而肝CYP450酶含量在臨床劑量與高劑量下,與模型組相比,均無顯著性差異。寒痹停片組與制馬錢子粉組之間,肝指數與CYP450酶含量均無顯著性差異。結論1.寒痹停片及制馬錢子粉中馬錢子堿與士的寧在健康大鼠體內多次給藥的藥動學過程符合一房室模型。寒痹停片復方配伍可使制馬錢子粉中馬錢子堿的清除率顯著降低,說明寒痹停片復方配伍對制馬錢子粉中馬錢子堿的體內消除過程有影響。給藥3天后,寒痹停片及制馬錢子粉中馬錢子堿與士的寧的血藥濃度均達穩(wěn)態(tài),并未出現(xiàn)隨著給藥時間的延長,血藥濃度持續(xù)增加的現(xiàn)象。提示臨床給藥劑量下,長期給予寒痹停片及制馬錢子粉不會引起毒性成分在正常大鼠體內蓄積導致血藥濃度的持續(xù)疊加升高,引起中毒現(xiàn)象發(fā)生的可能。2.寒痹停片及制馬錢子粉不同給藥劑量下,馬錢子堿與士的寧在佐劑大鼠體內多次給藥的藥動學過程均符合一房室模型。各組中的馬錢子堿與士的寧的血藥濃度在給藥3天后均達穩(wěn)態(tài),沒有出現(xiàn)隨著給藥次數的增加血藥濃度升高,大鼠死亡的現(xiàn)象。提示在非致死劑量下,長期給予寒痹停片及制馬錢子粉不會引起毒性成分在佐劑大鼠體內蓄積導致血藥濃度的持續(xù)疊加升高,引起中毒現(xiàn)象發(fā)生的可能。寒痹停片與制馬錢子粉相比,在臨床劑量下,馬錢子堿的吸收極顯著增加;高劑量下,馬錢子堿的吸收速度極顯著加快,吸收量顯著增加,馬錢子堿與士的寧的消除速度顯著加快。提示寒痹停片復方配伍可促進制馬錢子粉中馬錢子堿的吸收,劑量越高,配伍因素對馬錢子堿與士的寧吸收與消除的影響越大。3.在臨床給藥劑量下,佐劑大鼠與健康大鼠相比,C_(max)與AUC_(0→t)均極顯著增加,CL/F顯著加快。提示在病理狀態(tài)下,寒痹停片及制馬錢子粉中的馬錢子堿與士的寧在大鼠體內的吸收可極顯著增加,消除速率顯著加快。4.佐劑性關節(jié)炎模型對大鼠肝臟有一定的損傷,可使大鼠的肝臟指數下降,但灌胃給予高劑量的寒痹停片及制馬錢子粉后,大鼠的肝指數又恢復正常,提示藥物對肝臟有一定的保護作用;在健康狀態(tài)或是病理狀態(tài)下,寒痹停片及制馬錢子粉對大鼠肝臟CYP450酶的含量均無顯著性影響,初步判定該藥物對肝酶活性沒有明顯的影響。
【學位單位】：河南中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：
馬錢子堿標準曲線
3 為馬錢子堿）圖 1 各血漿中馬錢子堿和士的寧的總離子流圖3.1.2 工作曲線的建立精密吸取“2.1.1”項下一系列的混合對照品溶液各 20μL，分別加入空白大鼠血漿 100μL ，使混合對照品濃度分別變?yōu)轳R錢子堿 0.059、0.234、0.938、3.750、7.501、15.002、30.003、60.006ng·mL-1，士的寧 0.122、0.482、1.922、7.688、15.375、30.750、61.504、123.008ng·mL-1的系列標準溶液，再按“2.4”項下血漿樣品處理方法處理，按“2.5”項下方法進樣，以待測物與內標峰面積比值（y），對待測物濃度（x）進行線性回歸
馬錢子堿在寒痹停片及制馬錢子粉中的平均血藥濃度-時間曲線（n=8）
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