目的:建立多指標(biāo)同時(shí)測定牛膝的甾酮類和皂苷類化學(xué)成分的定量方法;多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選牛膝酒炙工藝;觀察牛膝甾酮皂苷化學(xué)部位和牛膝多糖抗軟骨細(xì)胞凋亡作用,多糖、甾酮皂苷化學(xué)部位配伍使用能否增效。有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究豐富牛膝質(zhì)控方法,為牛膝的酒炙飲片加工提供合理的技術(shù)參數(shù),為牛膝的深入研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。方法:1.查閱文獻(xiàn)資料、開展預(yù)試驗(yàn),從β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro、牛膝皂苷Ⅱ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa和胡蘿卜苷中確定β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa為牛膝單體成分含量測定的指標(biāo)性成分;采用HPLC法,Agilent ZORBAX SB-C_(18)色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)為流動相,梯度洗脫(0~18min,17%A;18~20min,17%A→32%A;20~64min,32%A;64~65min,32%A→17%A);同時(shí)測定牛膝中β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量,檢測波長β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮250nm,人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa 203nm;并進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)考察。2.總甾酮以β-蛻皮甾酮為對照,采用UV法242nm波長下測定總甾酮含量;總皂苷以人參皂苷Ro為對照,香草醛-冰醋酸-高氯酸反應(yīng)顯色處理,采用UV法544nm波長下測定總皂苷含量;總多糖以葡萄糖為對照品,苯酚-濃硫酸反應(yīng)顯色處理,采用UV法584nm波長下測定總皂苷含量。3.選取酒種類、加酒量、悶潤時(shí)間3個(gè)考察因素,每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平,采用L_9(3~4)進(jìn)行正交設(shè)計(jì),以β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、總甾酮、總皂苷和總多糖為指標(biāo),綜合優(yōu)選牛膝的最佳酒炙工藝。4.按中國藥典2015年版一部牛膝項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定,制備牛膝段、酒牛膝飲片,比較牛膝藥材、牛膝段、酒牛膝中甾酮類、皂苷類和多糖類成分的含量變化情況。5.根據(jù)牛膝中甾酮、皂苷和多糖的理化性質(zhì),乙醇溶液提取,大孔吸附樹脂純化,制備牛膝總甾酮皂苷化學(xué)部位;醇提后的藥渣加水煎煮,乙醇分級沉淀制備牛膝總多糖,多指標(biāo)控制牛膝總甾酮皂苷、總多糖化學(xué)部位的質(zhì)量。6.大鼠灌胃7天后腹主動脈取血,制備含藥血清;培養(yǎng)C28/I2軟骨細(xì)胞系,優(yōu)化細(xì)胞鋪板數(shù)、硝普鈉造模濃度;分別加入體積分?jǐn)?shù)5%、10%、15%的甾酮皂苷和多糖化學(xué)部位含藥血清與硝普鈉共培養(yǎng)24、48、72小時(shí),確定藥物活性、給藥濃度和時(shí)間;5%以下不同濃度甾酮皂苷、多糖含藥血清配比組合,與硝普鈉共培養(yǎng)24小時(shí),確定增效活性及藥物濃度配比;MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。結(jié)果:1.建立了HPLC法同時(shí)測定牛膝及其炮制品中β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮等3個(gè)甾酮類成分和人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa等2個(gè)皂苷類成分含量的方法,所建立的方法重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確率高。β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa進(jìn)樣量分別在0.2180~2.7250μg(r=0.9998)、0.0796~0.9950μg(r=0.9999)、0.1548~1.9350μg(r=0.9999)、0.3520~4.4000μg(r=0.9998)和0.3380~4.2250μg(r=0.9998)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;加樣回收率分別為98.37%、101.66%、99.09%、99.25%和101.53%,相應(yīng)的RSD分別為0.87%、1.02%、1.74%、0.67%和1.28%。2.實(shí)驗(yàn)中建立的牛膝總甾酮、總皂苷含量測定的方法,準(zhǔn)確、簡便,分別在0.0260~0.0940mg/mL(r=0.9992)、0.0090~0.0990mg(r=0.9980)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,平均加樣回收率分別為98.85%、99.32%,RSD值分別為為1.89%、1.17%。建立的總多糖含量測定方法,簡便、易行,在0.0024~0.0289mg/mL(r=0.9994)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。3.優(yōu)選出的牛膝最佳酒炙工藝為牛膝段加10%(g/g)黃酒悶潤60min后炒炙15min,工藝驗(yàn)證表明該工藝簡便、易于控制、重復(fù)性良好。4.與牛膝藥材相比較,牛膝段飲片中甾酮類單體成分、總甾酮、總多糖的含量略有下降,而皂苷類單體成分、總皂苷的含量則明顯降低;與牛膝段相比較,牛膝酒炙后,甾酮類成分含量略有增加,人參皂苷Ro和總皂苷的含量出現(xiàn)較為明顯的增加;總多糖含量下降明顯。5.制得的三批次甾酮皂苷化學(xué)部位和多糖化學(xué)部位中5個(gè)單體成分和3種總成分的含量基本穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)所用制備牛膝甾酮皂苷化學(xué)部位、多糖化學(xué)部位的提取方法簡便可行,質(zhì)量穩(wěn)定。6.C28/I2細(xì)胞最佳損傷模型條件為鋪板數(shù)15×10~3個(gè)/孔,硝普鈉1mmol/L培養(yǎng)24小時(shí),與模型組相比,牛膝甾酮皂苷、多糖含藥血清均顯著提高細(xì)胞增殖活性(P0.05);以牛膝甾酮皂苷含藥血清為基礎(chǔ),配伍牛膝多糖,能顯著提高細(xì)胞增殖活性(P0.05),多糖-甾酮皂苷含藥血清最佳配比1.25%-5%。結(jié)論:本文建立了HPLC法同時(shí)測定牛膝及其炮制品中β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮3個(gè)甾酮類成分、人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa2個(gè)皂苷類成分的方法,UV法測定總甾酮、總皂苷和總多糖的方法,經(jīng)方法學(xué)考察以上方法均簡單、準(zhǔn)確、有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性,可用于牛膝及其復(fù)方制劑的質(zhì)量評價(jià);優(yōu)選出酒牛膝的最佳炮制工藝,簡便、易于控制、重復(fù)性良好;牛膝甾酮皂苷化學(xué)部位和多糖均具有抗軟骨細(xì)胞凋亡的作用,且兩者配伍增效明顯。
【學(xué)位單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5;R284
【部分圖文】：

取上述牛膝段和酒牛膝樣品，分別粉碎成細(xì)粉，按第一部分“2.3.2”項(xiàng)下制備單體成分含量測定的供試品溶液，分別按第二部分“2.1.1”、“2.1.1”、“2.3.1備總甾酮、總皂苷、總多糖含量測定供試品溶液。按第一部分“2.1.6”項(xiàng)下色譜測定 5 種單體成分含量，分別按第二部分“2.1.4”、“2.2.3”、“2.3.4”項(xiàng)下測法測定總甾酮、總皂苷、總多糖的含量。牛膝藥材、牛膝段、酒牛膝 5 種單體成 3 種總成分含量測定結(jié)果如表 4-1，牛膝及其炮制品各成分含量比較見柱狀圖 4-1-2，HPLC 色譜圖見附圖 4-1。表 4-1 牛膝、牛膝段和酒牛膝的含量測定結(jié)果（n=3，%）編號 β-蛻皮甾酮/%25R-牛膝甾酮/%25S-牛膝甾酮/%人參皂苷 Ro/%竹節(jié)參皂苷Ⅳ a/%總甾酮/%總皂苷/%總多/%藥材0.0626 0.0150 0.0235 0.0833 0.0424 0.4101 1.5756 10.81膝段 0.0561 0.0122 0.0226 0.0580 0.02560.36021.344810.52牛膝 0.0565 0.0136 0.0228 0.0638 0.02540.3913 1.6569 7.189

圖 4-2 牛膝及其炮制品 3 個(gè)總成分含量柱狀圖附圖 3-1 可以看出，牛膝藥材呈細(xì)長圓柱形，有時(shí)稍彎曲，上端較粗，約 15～70cm，直徑約 0.4～1cm，表面呈灰黃色或淡棕色，具細(xì)微的縱皺根痕；牛膝段為圓柱形 5～10mm 的短段，外表皮灰黃色或淡棕色，有微橫長皮孔，切面平坦，淡棕色或棕色，略呈角質(zhì)樣而油潤，中心維管束白色，其外圍散有多數(shù)黃白色點(diǎn)狀維管束，斷續(xù)排列成 2～4 輪；酒牛膝大小相似，表面色略深，偶見焦斑，切面皮部略有膨大，筋脈點(diǎn)不明顯。膝藥材制成牛膝段的過程中重量變化較小，損失部分主要是蘆頭的重量后，重量變化也較小，200g 牛膝段酒炙后能得到約 193g 酒牛膝，損失部時(shí)產(chǎn)生的碎屑。實(shí)驗(yàn)中，按《中國藥典》2015 年版一部牛膝項(xiàng)下方法制備了牛膝藥材的飲片和酒牛膝飲片。在實(shí)驗(yàn)中采用 HPLC 法同時(shí)測定了牛膝及其炮制品、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮等 3 個(gè)甾酮類成分和人參皂苷 Ro、竹節(jié)

圖 6-1 牛膝有效成分保護(hù)損傷軟骨細(xì)胞時(shí)效性由相對于模型組顯著性表 6-5 可知，培養(yǎng) 24h 除混合物中濃度組、混合物高濃度組沒有顯著性差異（P＞0.05）外，其余各組均有顯著性（P＜0.05）；培養(yǎng) 48h 除多糖低濃度組、甾酮皂苷部位中濃度組、混合物中濃度組、混合物高濃度組沒有顯著性差異（P＞0.05）外，其余各組均有顯著性（P＜0.05）；培養(yǎng) 72h 多糖低濃度組、多糖-甾酮皂苷部位低濃度組、多糖-甾酮皂苷部位中濃度組有顯著性（P＜0.05），其余各組均無明顯顯著性（P＞0.05）。由牛膝有效成分保護(hù)損傷軟骨細(xì)胞時(shí)效性的圖 6-1 可以明顯看出與含藥血清共培養(yǎng) 24h，加含藥血清各組對硝普鈉損傷軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用十分顯著，而與含藥血清共培養(yǎng) 48h，72h，保護(hù)作用不明顯，因此選用與含藥血清共培養(yǎng) 24h。2.5.2 牛膝多糖、甾酮皂苷化學(xué)部位不同配比對軟骨細(xì)胞凋亡的影響2.5.2.1 接種取生長良好的第 3 代軟骨細(xì)胞 ，以 15×103/孔接種于 96 孔板上，板的邊緣各孔分別加入 200uL PBS 緩沖液，用含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基 5%CO2，37℃培養(yǎng) 24h。2.5.2.2 干預(yù)
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊柳;張穎;劉季田媛;姜海;楊炳友;王秋紅;肖洪彬;匡海學(xué);;牛膝補(bǔ)腎壯骨有效部位抗炎、鎮(zhèn)痛作用研究[J];中醫(yī)藥學(xué)報(bào);2015年06期

2 邱蕓;姜勇;梅芳;;兔膝OA腔內(nèi)注射牛膝多糖對軟骨細(xì)胞凋亡的影響[J];中國民族民間醫(yī)藥;2015年22期

3 楊柳;張穎;劉季田媛;姜海;楊炳友;王秋紅;肖洪彬;匡海學(xué);;牛膝各化學(xué)拆分組分指紋圖譜研究[J];中醫(yī)藥信息;2015年06期

4 劉淵;孫雪蓮;周紅海;楊柯;;牛膝總皂苷含藥血清對兔膝軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J];時(shí)珍國醫(yī)國藥;2015年10期

5 張穎;楊柳;張妍妍;姜海;楊炳友;王秋紅;肖洪彬;匡海學(xué);;牛膝各化學(xué)拆分組分的含量測定[J];中醫(yī)藥信息;2015年05期

6 李成付;王玖忠;邊瑜健;潘中瑛;王杰;謝小軍;楊小秋;;牛膝醇提物促進(jìn)兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)的作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國臨床研究;2015年07期

7 潘琦;穆春旭;張建軍;;不同地區(qū)產(chǎn)牛膝齊墩果酸、蛻皮甾酮含量的比較研究[J];中國當(dāng)代醫(yī)藥;2015年12期

8 劉斌;王彥志;張萌;劉洋;;牛膝的化學(xué)成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展[J];河南中醫(yī);2014年11期

9 鄒來勇;方芳;湯群珍;;牛膝多糖對兔膝骨關(guān)節(jié)炎骨橋蛋白表達(dá)的影響[J];光明中醫(yī);2014年08期

10 田碩;苗明三;;牛膝的化學(xué)、藥理及應(yīng)用特點(diǎn)探討[J];中醫(yī)學(xué)報(bào);2014年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 孟大利;中藥牛膝化學(xué)成分及其生物活性的研究[D];沈陽藥科大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張?jiān)?植物生長物質(zhì)對牛膝生長及主要藥用成分積累的影響[D];河南師范大學(xué);2015年

本文編號：2885001