目的觀察山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside,CIG)對創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)大鼠認知功能及tau蛋白過度磷酸化的影響。方法采用改良自由落體Feeney法致右側(cè)大腦皮質(zhì)損傷制備TBI大鼠模型。造模后3 h開始給藥,持續(xù)給藥28 d。應用避暗試驗檢測大鼠被動回避記憶能力,應用Fluoro Jade B染色檢測變性神經(jīng)元,采用Western blotting法檢測tau蛋白磷酸化的水平。結(jié)果 TBI造模術(shù)后28 d,模型組大鼠在避暗試驗中的錯誤次數(shù)增多,海馬區(qū)變性神經(jīng)元增多,創(chuàng)傷部位tau蛋白磷酸化水平增高。CIG灌胃給藥28 d能夠改善TBI大鼠的被動回避記憶功能障礙,減輕海馬區(qū)神經(jīng)元退行性病變,抑制TBI大鼠腦創(chuàng)傷部位tau蛋白在Thr205和Ser396位點的過度磷酸化。結(jié)論 CIG對腦創(chuàng)傷所致認知功能障礙可能具有治療作用。
【部分圖文】：

將大鼠麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺上,開胸暴露心臟。由主動脈弓進針,在右心耳處剪開一小口,先后灌入0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液和4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛,四肢僵硬即固定完成,分離取出腦組織。將取出的腦組織浸于含4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛和30%(質(zhì)量分數(shù))蔗糖的后固定液中脫水。固定好的腦組織進行冰凍切片,得到厚度為20 μm的腦片。之后用特異性標記變性神經(jīng)元的熒光染料Fluoro Jade B,參照文獻[12]中方法進行Fluoro Jade B染色。每只大鼠隨機選取3張腦片,貼于預先明膠處理過的載玻片上。待自然晾干。按照以下步驟染色:①貼片浸入含1%(質(zhì)量分數(shù))NaOH的80%(體積分數(shù))乙醇溶液中5 min;②貼片入70%(體積分數(shù))乙醇溶液中20 min,之后蒸餾水中浸洗2 min;③貼片入0.06%(質(zhì)量分數(shù))高錳酸鉀溶液中10 min,蒸餾水沖洗2 min;④貼片于0.000 4%(質(zhì)量分數(shù))Fluoro Jade B染色液[溶于0.1%(體積分數(shù))乙酸]中染色20 min,之后蒸餾水沖洗3 min;⑤貼片在50 ℃條件下烘干,用DAPI封片劑封片后,在熒光顯微鏡下觀察及拍照。1.7 Western blotting法檢測

在TBI術(shù)后28 d進行避暗試驗,記錄大鼠在第2次訓練24 h后首次進入暗室的時間(步入潛伏期)以及進入暗室的次數(shù)(錯誤次數(shù))。步入潛伏期在各組小鼠間差異無統(tǒng)計學意義(圖1A);模型組大鼠進入暗室的錯誤次數(shù)與假手術(shù)組相比顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而灌胃給予CIG(30、60、120 mg/kg)28 d能夠降低TBI大鼠的錯誤次數(shù),其中CIG中劑量與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1B)。2.2 CIG對TBI大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元變性的影響

應用Western blotting法檢測TBI大鼠創(chuàng)傷部位磷酸化tau蛋白的表達。與假手術(shù)組比較,TBI模型組大鼠創(chuàng)傷部位tau蛋白在蘇氨酸(Thr)205位點和絲氨酸(Ser)396位點的磷酸化水平顯著增高(P<0.05);而給予CIG能夠降低TBI大鼠tau蛋白Thr205位點的磷酸化水平,其中CIG中、大劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);給予CIG也能夠降低tau蛋白Ser396位點的磷酸化水平,其中CIG大劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組小鼠的總tau蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見圖3。3 討論
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