腦卒中又稱腦中風或腦血管意外,是由于腦部供血障礙或腦血管破裂引起的一種急性腦血管疾病,分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種,死亡率和致殘率極高,嚴重威脅著人類的生命健康。然而,由于缺血性腦卒中病理進程復雜,迄今為止正式被批準使用的有效治療藥物還為數不多。中藥復方小續(xù)命湯是治療缺血性腦卒中的經典方劑,小續(xù)命湯有效成分組是依據小續(xù)命湯適應癥腦缺血的發(fā)病機制,通過體外篩選模型優(yōu)化確定的小續(xù)命湯抗腦缺血的有效藥理活性組分。我們前期研究證實小續(xù)命湯有效成分組能夠作用于缺血區(qū)神經細胞線粒體,顯著改善缺血后神經元線粒體能量代謝障礙,提高線粒體膜電位,抑制線粒體凋亡途徑。近年來的研究發(fā)現,腦缺血再灌注損傷與線粒體自噬功能紊亂有著密切的聯系,缺血性損傷導致線粒體功能受損,而線粒體自噬清除受損線粒體,完成損傷線粒體的降解,維持自身穩(wěn)態(tài)平衡,實現線粒體質量控制,因此靶向調節(jié)線粒體自噬或能降低腦缺血再灌注損傷�；诖�,本課題以線粒體自噬為切入點,提出線粒體網絡的穩(wěn)態(tài)失衡在缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義,小續(xù)命湯有效成分組可通過調節(jié)線粒體自噬,調控線粒體穩(wěn)態(tài)失衡改善神經元功能來治療缺血性腦卒中。因此,本研究采用局灶性腦缺血再灌注大鼠為觀察對象,以小續(xù)命湯有效成分組為干預手段,探討小續(xù)命湯有效成分組對模型大鼠腦缺血改善情況,觀察其對線粒體功能及線粒體自噬變化的影響,從調節(jié)線粒體自噬的角度揭示小續(xù)命湯有效成分組對缺血性腦卒中的作用機制。第一部分小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體功能損傷的影響目的考察小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體功能損傷的影響。方法選用健康雄性SD大鼠,體重250 g-280 g,隨機分為假手術(Sham)組、模型(Model)組、小續(xù)命湯有效成分組(XXMD)低、中、高劑量組和金納多(EGb 761)組,插線法制備大鼠右側大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型,缺血2 h后實現再灌注,假手術組大鼠不進行線栓插入操作。待大鼠清醒后給予藥物,小續(xù)命湯有效成分組和金納多均采用灌胃給藥,每日一次,連續(xù)四天。測定給藥4天時MCAO大鼠缺血周邊區(qū)大腦皮層組織線粒體膜腫脹度、ATP酶活性(Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase)以及線粒體超氧陰離子(O2)和鈣離子含量,研究小續(xù)命湯有效成分組對腦缺血再灌注大鼠腦線粒體功能的影響。結果與模型組相比,給藥4天時小續(xù)命湯有效成分組能夠顯著改善MCAO大鼠的腦線粒體功能損傷,表現為顯著改善腦缺血再灌注大鼠腦線粒體Na+-K+-ATPase(P0.05,P0.01)和 Ca2+-Mg2+-ATPase 活力(P0.05,P0.01),降低線粒體鈣離子含量(P0.01)和超氧陰離子含量(P0.05)。結論小續(xù)命湯有效成分組能夠減輕腦缺血再灌注導致的線粒體氧化應激反應和鈣超載,改善線粒體功能。第二部分小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體自噬的影響及作用機制研究目的考察小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層神經元不同時間點線粒體自噬的影響及相關機制。方法選用健康雄性SD大鼠,體重250 g-280 g,隨機分為假手術(Sham)組、模型(Model)組、小續(xù)命湯有效成分組(XXMD)中劑量組和自噬激活劑雷帕霉素(RAP)組,插線法制備大鼠右側大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型,缺血2 h后實現再灌注,假手術組大鼠不進行線栓插入操作。待大鼠清醒后給予藥物,小續(xù)命湯有效成分組采用灌胃給藥,雷帕霉素采用腹腔注射給藥,每日一次,連續(xù)四天。采用Zea-Longa's級標準評分法和神經功能缺損評分(mNSS)實驗來測評小續(xù)命湯有效成分組和雷帕霉素給藥對局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學的影響,TTC染色法檢測大鼠腦梗死體積百分比和半球腫脹。Western blot法檢測給藥后24h、48h、72h和96h時自噬及線粒體自噬相關蛋白LC3、P62、Beclin-1及BNIP3的表達水平變化,透射電鏡觀察再灌注24h時缺血半暗帶皮層神經元細胞中線粒體形態(tài)及線粒體自噬超微結構。結果與模型組相比,給藥4天時小續(xù)命湯有效成分組和雷帕霉素能夠顯著改善MCAO大鼠神經功能缺損,表現為降低MCAO大鼠mNSS評分(P0.05,P0.01),延長MCAO大鼠在平衡木上的停留時間(P0.05,P0.01)。TTC結果顯示,小續(xù)命湯有效成分組和雷帕霉素能夠顯著減少給藥4天時MCAO大鼠腦組織梗死體積百分比(P0.05,P0.01),并可顯著縮小其半球腫脹(P0.01)。Western blot檢測結果顯示,腦缺血再灌注24 h時,缺血周邊區(qū)腦組織中自噬及線粒體自噬均被顯著激活,表現為細胞總蛋白和純化線粒體蛋白中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化顯著增多(P0.05,P0.01),細胞總蛋白中P62、Beclin-1及BNIP3的表達水平發(fā)生下降(P0.05),而純化線粒體蛋白中P62及BNIP3的表達水平則顯著上升(P0.05,P0.01)。缺血再灌注48 h時線粒體自噬被抑制,且隨著再灌注時間的延長,線粒體自噬出現持續(xù)下降現象。與模型組相比,小續(xù)命湯有效成分組給藥24 h時,能夠通過降低 P62、Beclin-1、BNIP3 的表達水平以及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 的比值(P0.05,P0.01)抑制腦缺血再灌注后24 h時線粒體自噬的過度激活。其對線粒體自噬的抑制作用延續(xù)至再灌注48 h,隨著時間進一步延長,小續(xù)命湯有效成分組對線粒體自噬的抑制作用消失。缺血再灌注時間延長至96 h時,小續(xù)命湯有效成分組對P62、Beclin-1及BNIP3的表達出現明顯激活作用(P0.05,P0.01),并能增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(P0.05),從而激活線粒體自噬,促進受損線粒體的自噬性清除。電鏡檢測結果顯示,腦缺血再灌注24 h時,模型組大鼠腦組織神經元細胞中有大量空泡結構的自噬泡及大量線粒體自噬結構。與模型組相比,XXMD給藥組大鼠腦神經元核膜較為完整,細胞器較模型組明顯增多,自噬泡及線粒體自噬結構明顯減少。結論腦缺血再灌注后線粒體自噬隨病程進展呈現先激活后抑制現象,過高和過低的線粒體自噬均不利于神經細胞的存活。小續(xù)命湯有效成分組能夠調節(jié)缺血后不同時間點自噬及線粒體自噬相關蛋白的表達水平,抑制缺血再灌注后24h時線粒體自噬的過度激活,促進缺血再灌注后期線粒體自噬。第三部分應用線粒體自噬抑制劑后觀察小續(xù)命湯有效成分組對腦缺血再灌注損傷的影響目的考察應用線粒體自噬抑制劑mdivi-1后對小續(xù)命湯有效成分組腦缺血再灌注損傷保護作用的影響及機制。方法選用健康雄性SD大鼠,體重250 g-280g,隨機分為假手術(Sham)組、模型(Model)組、小續(xù)命湯有效成分組(XXMD)中劑量組、小續(xù)命湯有效成分組聯合線粒體自噬抑制劑mdivi-1作用(XXMD+MDI)組及線粒體自噬抑制劑mdivi-1組,插線法制備大鼠右側大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型,缺血2 h后實現再灌注,假手術組大鼠不進行線栓插入操作。待大鼠清醒后給予藥物,小續(xù)命湯有效成分組采用灌胃給藥,mdivi-1采用腹腔注射給藥,每日一次,連續(xù)四天。采用Zea-Longa's級標準評分法和神經功能缺損評分(mNSS)實驗來觀察小續(xù)命湯有效成分組以及小續(xù)命湯有效成分組聯合mdivi-1給藥對局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學的影響,TTC染色法檢測大鼠腦梗死體積百分比和半球腫脹,Western blot法檢測給藥4天時,MCAO大鼠腦線粒體中自噬及線粒體自噬相關蛋白LC3、P62、Beclin-1及BNIP3的表達水平。結果與XXMD組相比,應用線粒體自噬抑制劑mdivi-1后,小續(xù)命湯有效成分組對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用顯著減弱,表現為MCAO大鼠mNSS評分升高(P0.05),在平衡木上的停留時間減少(P0.05),腦組織梗死體積百分比增多(P0.01),并可增加其半球腫脹(P0.05)。Western blot檢測結果顯示,應用線粒體自噬抑制劑mdivi-1后,小續(xù)命湯有效成分組大鼠腦線粒體P62和Beclin-1的表達降低(P0.05,P0.01),LC3-I向LC3-II的轉化減少(P0.05),說明線粒體自噬減弱。結論線粒體自噬抑制劑mdivi-1能夠抑制線粒體自噬,并能進一步加重腦缺血再灌注損傷。應用線粒體自噬抑制劑mdivi-1后,小續(xù)命湯有效成分組對MCAO大鼠的神經功能保護作用顯著降低,說明小續(xù)命湯有效成分組可能通過調節(jié)線粒體自噬發(fā)揮神經保護作用。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
縮略詞表
摘要
Abstract
前言
第一部分 小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體功能損傷的影響
    引言
    1. 實驗材料
    2. 實驗方法
    3. 實驗結果
    4. 小結
第二部分 小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體自噬的影響及作用機制研究
    引言
    第一節(jié) 小續(xù)命湯有效成分組和自噬激動劑雷帕霉素對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經保護作用比較
        1. 實驗材料
        2. 實驗方法
        3. 實驗結果
        4. 小結
    第二節(jié) 大鼠局灶性腦缺血再灌注后自噬及線粒體自噬的變化
        1. 實驗材料
        2. 實驗方法
        3. 實驗結果
        4. 小結
    第三節(jié) 小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體自噬的影響
        1. 實驗材料
        2. 實驗方法
        3. 實驗結果
        4. 小結
第三部分 應用線粒體自噬抑制劑后觀察小續(xù)命湯有效成分組對腦缺血再灌注大鼠腦損傷的影響
    引言
    第一節(jié) 應用線粒體自噬抑制劑后觀察小續(xù)命湯有效成分組對腦缺血再灌注大鼠神經保護作用的影響
        1. 實驗材料
        2. 實驗方法
        3. 實驗結果
        4. 小結
    第二節(jié) 應用線粒體自噬抑制劑后觀察小續(xù)命湯有效成分組對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體自噬的影響
        1. 實驗材料
        2. 實驗方法
        3. 實驗結果
        4. 小結
第四部分 綜合討論
第五部分 結論
本研究的創(chuàng)新點
本研究的不足之處
參考文獻
第六部分 文獻綜述 線粒體自噬在腦缺血再灌注中的研宄進展
    參考文獻
個人簡介
致謝

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本文編號：2867057