丙型肝炎是由丙型肝炎病毒感染引起的一種重大傳染性疾病,其慢性感染會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等一系列嚴(yán)重疾病。近年來(lái)針對(duì)病毒蛋白的直接抗病毒藥物(DAAs)的研發(fā)取得了巨大進(jìn)展,但DDAs引發(fā)的耐藥、HCV合并HBV或HIV感染的治療、特殊人群感染的治療等諸多問(wèn)題,迫使我們?nèi)孕鑼ふ倚滦偷目笻CV藥物。本論文利用本室建立的HCV蛋白酶抑制劑高通量篩選模型,對(duì)國(guó)家新藥(微生物)篩選實(shí)驗(yàn)室樣品庫(kù)中的樣品進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)黃芩素及黃芩苷具有抗HCV NS3/4A蛋白酶活性。研究報(bào)道黃芩苷及黃芩素具有抗呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒(NDV)、流感病毒(H1N1)、登革熱病毒(DENV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)等多種病毒的作用,然而其作用機(jī)制不明確,也尚未見(jiàn)其有直接抗HCV活性的研究報(bào)道。所以本論文利用本室建立的一系列抗HCV藥物研發(fā)模型對(duì)黃芩苷的抗HCV活性做了深入研究。本論文研究結(jié)果顯示,黃芩苷具有抗HCV NS3/4A蛋白酶的活性,其抑制蛋白酶的Ki值為63.22±0.98μM。由于NS3蛋白還具有解旋酶的活性,為分析黃芩苷對(duì)NS3解旋酶是否還具有影響作用,本論文建立了HCV解旋酶抑制劑高通量篩選模型,優(yōu)化了反應(yīng)條件。隨后利用此模型分析顯示黃芩苷對(duì)HCV解旋酶無(wú)抑制作用,提示黃芩苷對(duì)HCV NS3/4A蛋白的蛋白酶活性具有特異性。為進(jìn)一步分析黃芩苷抗HCV的活性,本論文首先檢測(cè)了黃芩苷在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)急性感染HCV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示,黃芩苷在Huh7.5細(xì)胞內(nèi)具有抗急性感染HCV復(fù)制的作用,其對(duì)細(xì)胞的毒性的CC_(50)為781.7±144.1μM,抑制HCV復(fù)制的EC_(50)為31.3±9.56μM,其抑制活性在蛋白表達(dá)水平上也得到確證。DAA治療常出現(xiàn)耐藥,常見(jiàn)的有如A156T和D168V的蛋白酶抑制劑耐藥突變位點(diǎn)及S282T的多聚酶抑制劑耐藥突變位點(diǎn),為分析黃芩苷對(duì)耐藥病毒的治療作用,本論文首先進(jìn)行了耐藥突變HCV病毒株的建立及驗(yàn)證。結(jié)果顯示,已成功建立了蛋白酶抑制劑和多聚酶抑制劑耐藥突變病毒及其實(shí)驗(yàn)分析方法,其耐藥倍數(shù)分別為40、34和4倍,而黃芩苷對(duì)耐藥突變HCV病毒株的活性與其對(duì)野生型病毒的活性相似,提示黃芩苷對(duì)耐藥突變HCV病毒株也具有治療作用。為了進(jìn)一步分析黃芩苷在抗HCV方面的可應(yīng)用性,本論文初探了黃芩苷與已知臨床應(yīng)用的抗病毒藥物的聯(lián)合抗HCV活性。結(jié)果顯示,黃芩苷與蛋白酶抑制劑simeprevir聯(lián)用存在拮抗作用,但黃芩苷與多聚酶抑制劑sofosbuvir聯(lián)用則有協(xié)同抗病毒作用。結(jié)論:黃芩苷在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)具有抗HCV的作用,對(duì)已知常見(jiàn)耐藥病毒也有效,與不同作用靶點(diǎn)的藥物具有協(xié)同抗病毒的作用,其抗病毒作用機(jī)制可能是通過(guò)特異性地抑制HCV蛋白酶。
【學(xué)位單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

北京工業(yè)大學(xué)工程碩士專業(yè)學(xué)位論文合的膜蛋白，NS5A 是高度磷酸化的蛋白，形成 RNA 復(fù)制復(fù)合體，與復(fù)關(guān)。NS4B 和NS5A 的具體功能尚不明確，NS5B 是一個(gè) RNA 依賴的 RN合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）[12-16]。另外，存在一種閱替代蛋白(alternative reading frame protein，ARFP)，又稱 F(frameshift)蛋白翻譯過(guò)程中Core蛋白編碼序列的核糖體閱讀框發(fā)生-2 或+1 位移所致[17,18]。

圖 1- 2. HCV 的生命周期CV基因組具有多樣性，到目前為止已經(jīng)檢測(cè)到七種基因型[21][22]，每因序列差異為 31%~33%，每個(gè)亞型間的差異達(dá) 20%~25%[23-25]。因型分布不同[26]論上講，阻斷HCV復(fù)制周期中任何一個(gè)環(huán)節(jié)都可抑制病毒復(fù)制，段、HCV復(fù)制階段、HCV釋放階段等。在以干擾素（Interferon ,療時(shí)代之后，開(kāi)發(fā)了一系列稱為直接作用于病毒的抗病t-acting antiviral agents，DAA）。目前已知抗HCV藥物可分為三蛋白酶抑制劑、NS5B聚合酶抑制劑和NS5A抑制劑，如表 1-1 �；蛐� 1 在美洲，歐洲，澳大利亞，新西蘭，區(qū)更為普遍�；蛐� 3 在印度和巴基斯坦最常見(jiàn)，基因型 4 以南位�；蛐� 5 占南非HCV感染的三分之一，而基因型 6 主要在 5 月美國(guó) FDA 批準(zhǔn)上市的第一代 DAAs-特拉匹韋（Telaprev匹韋（Boceprevir, BOC），這類藥物治療會(huì)造成嚴(yán)重甚至致死的第一代DAAs極易誘導(dǎo)HCV病毒耐藥突變[28,29]最終常造成治療的

第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 4 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 HCV蛋白酶抑制劑的篩選及黃芩苷抑制HCV蛋白酶的活性4.1.1 HCVNS3/4A 蛋白酶提取將帶有表達(dá)融合麥芽糖的HCV NS3/4A蛋白（1a型）的質(zhì)粒pMAL-c2-NS3/4A轉(zhuǎn)化菌DH5α菌株，在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中 37℃振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600≈0.6 時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng) 4 h。離心收集菌株后，于冰浴中超聲破碎并收集上清。在 4℃層析柜中用AKTA監(jiān)測(cè)分離純化(圖 4-1）。如圖 3 所示，當(dāng)用含有麥芽糖的緩沖液洗脫已經(jīng)吸附了HCV NS3/4A融合蛋白的Amylose Resin填料時(shí)，AKTA的紫外監(jiān)測(cè)系統(tǒng)顯示有紫外峰值，調(diào)整收集器收集此部分洗脫液，得到HCVNS3/4A蛋白樣品。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 夏永建;無(wú)償獻(xiàn)血者抗-HCV流行狀況的初步調(diào)查[J];交通醫(yī)學(xué);2002年03期

2 王雨晴;溶血對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定抗-HCV結(jié)果的影響[J];四川醫(yī)學(xué);2004年12期

3 孫志國(guó);綦江地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者HCV檢測(cè)結(jié)果分析[J];重慶醫(yī)學(xué);2005年10期

4 孫淑莉;張鳳蓮;施岳雨;桐春;張立新;;丙型肝炎病毒抗體(HCV)檢測(cè)的臨床意義[J];石河子科技;2006年01期

5 竇志華,倪紅兵,周興娣,郭薇;4273份袋血輸血前抗—HCV復(fù)檢[J];南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1996年02期

6 高標(biāo),蔣素銀,李保巠;Ⅱ型自身免疫性肝炎患者抗-HCV的檢測(cè)[J];上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志;1997年01期

7 孫桂芝;王鑫;;濟(jì)南市無(wú)償獻(xiàn)血者抗-HCV流行情況調(diào)查研究[J];中國(guó)誤診學(xué)雜志;2006年03期

8 胡碧芳;劉峰;;荊州市無(wú)償獻(xiàn)血者抗-HCV的檢測(cè)結(jié)果分析[J];中國(guó)輸血雜志;2012年S1期

9 沈昭在;;用套式聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定HCV的母嬰傳播[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè);1992年05期

10 孟昭鵬;;輸入抗-HCV陰性血發(fā)生丙型肝炎病毒感染[J];傳染病信息;1995年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 李樊;HIV-1和HCV在注射吸毒人群的傳播瓶頸和毒株起源[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2017年

2 鄢然;1b型HCV研究模型的建立及蝎源抗菌肽抑制HCV感染的初步探討[D];武漢大學(xué);2010年

3 楊敬;表達(dá)外源基因的HCV微型基因組的構(gòu)建及初步應(yīng)用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

4 閻少多;HCV小鼠模型的建立及其在肝臟免疫損傷研究中的應(yīng)用[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李健蕊;黃芩苷抗HCV藥效學(xué)研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2017年

2 趙法寶;新型吲哚類HCV非核苷類NS5B抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和活性評(píng)價(jià)[D];山東大學(xué);2016年

3 吳夢(mèng)平;維生素D及維生素D受體基因多態(tài)性與高危人群HCV易感性及感染轉(zhuǎn)歸關(guān)系的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

4 尹麗;健脾清化方含藥血清對(duì)HCV感染的HepG2細(xì)胞作用的體外研究[D];河南中醫(yī)藥大學(xué);2017年

5 康富標(biāo);HIV/HCV共感染者HAART后HCV特異性T細(xì)胞反應(yīng)的規(guī)律研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2008年

6 趙晶;中國(guó)中西部四省高危人群HIV/HCV共感染及HCV亞型初步分析[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2009年

7 薛蘭潔;HCV對(duì)樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞的感染性研究[D];昆明理工大學(xué);2013年

8 鐘祿彪;HCV主要受體樹(shù)鼩肝組織特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及功能研究[D];昆明理工大學(xué);2015年

9 盧莎;嵌合1a與1b亞型包膜蛋白基因HCV細(xì)胞培養(yǎng)模型的初步研究[D];內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院;2009年

10 傅濤;HCV多表位復(fù)合抗原合成肽的免疫學(xué)性狀分析[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2005年

本文編號(hào)：2866174