在全球范圍內(nèi),胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第5位,死亡率居第3位;結(jié)直腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第3位,死亡率居第2位。中醫(yī)藥在腫瘤的治療中應用廣泛,具有獨特的優(yōu)勢和巨大的潛力。同時,由于中藥多成分、多靶點和多途徑協(xié)同作用的復雜性及傳統(tǒng)實驗方法的局限性,大多數(shù)中藥的藥效物質(zhì)基礎、分子靶標及作用機制仍然不明確,這成為中藥應用和中藥新藥研發(fā)的主要障礙之一。白花蛇舌草是中醫(yī)常用的清熱類藥,具有清熱解毒、消癰散結(jié)、利尿除濕等功效,臨床上廣泛應用于胃腸道癌的治療,然而其作用機制尚未充分闡明。網(wǎng)絡藥理學以“疾病-基因-靶點-藥物”多層次、多角度的相互作用網(wǎng)絡為理念,系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡的干預與影響,已廣泛應用于中藥作用機制的研究�；诖�,本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法探索白花蛇舌草抗胃腸道癌的作用機制。研究目的通過整合基因表達譜分析確認胃腸道癌潛在預后標志物。通過網(wǎng)絡藥理學方法預測、辨識白花蛇舌草治療胃腸道癌的活性成分、作用靶點和信號通路,構(gòu)建生物分子網(wǎng)絡,力求從系統(tǒng)層面揭示白花蛇舌草抗胃腸道癌的多成分、多靶點、多通路復雜機制。研究方法1.整合基因表達譜分析在基于整合基因表達譜的胃癌潛在預后標志物研究中,從GEO數(shù)據(jù)庫下載9個胃癌基因表達譜芯片數(shù)據(jù)集,利用R語言中的limma包對每個數(shù)據(jù)集分別進行差異表達分析,進一步通過RobustRankAggreg包進行整合分析,篩選出在9個數(shù)據(jù)集中共同被確認為差異表達的基因。從TCGA數(shù)據(jù)庫下載胃腺癌mRNA測序數(shù)據(jù)和病人的臨床信息,利用edgeR包確認差異表達基因,并將這些基因與胃癌芯片數(shù)據(jù)集整合分析得到的差異基因取交集,篩選共同的差異基因。使用STRING獲取差異基因的蛋白相互作用信息,導入Cytoscape構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡,并利用MCODE進行模塊分析,獲得網(wǎng)絡的核心基因。通過DAVID對核心模塊中的基因進行GO富集分析,通過clusterProfiler包對核心模塊中的基因進行KEGG通路富集分析。合并TCGA中胃癌患者的生存數(shù)據(jù)和基因表達數(shù)據(jù),采用survival包進行單因素Cox回歸分析,選取P0.05的基因進行多因素Cox回歸分析。基于所選基因表達譜和回歸系數(shù)構(gòu)建生存相關的線性風險評估模型,計算每個樣本的風險值,通過Kaplan-Meier和Log-rank檢驗的方法評估高、低風險組樣本總體生存率的差異,采用時間依賴性ROC曲線評價該預后模型對時間依賴性癌癥死亡的預測準確性。在基于整合基因表達譜的結(jié)直腸癌潛在預后標志物研究中,從GEO數(shù)據(jù)庫下載6個結(jié)直腸癌基因表達譜芯片數(shù)據(jù)集,利用limma包對每個數(shù)據(jù)集分別進行差異表達分析,進一步通過RobustRankAggreg包進行整合分析,篩選出在6個數(shù)據(jù)集中共同被確認為差異表達的基因。從TCGA數(shù)據(jù)庫下載結(jié)腸腺癌mRNA測序數(shù)據(jù)和病人的臨床信息,利用edgeR包確認差異表達基因,并將這些基因與結(jié)直腸癌芯片數(shù)據(jù)集整合分析得到的差異基因取交集,篩選共同的差異基因。采用KEGG的功能注釋信息,通過clusterProfiler包分別對7個數(shù)據(jù)集中的全部基因進行GSEA富集分析。合并TCGA中結(jié)腸癌患者的生存數(shù)據(jù)和基因表達數(shù)據(jù),采用survival包進行單因素Cox回歸分析,通過glmnet包對P0.05的基因進行LASSO Cox回歸分析,最后應用survival包對LASSO Cox回歸分析確認的生存相關基因進行多因素Cox回歸分析。基于所選基因表達譜和回歸系數(shù)構(gòu)建生存相關的線性風險評估模型,計算每個樣本的風險值,通過Kaplan-Meier和Log-rank檢驗的方法評估高、低風險組樣本總體生存率的差異,采用時間依賴性ROC曲線評價該預后模型對時間依賴性癌癥死亡的預測準確性。2.網(wǎng)絡藥理學分析在白花蛇舌草治療胃癌作用機制的網(wǎng)絡藥理學研究中,通過TCMSP、TCMID獲得白花蛇舌草的化學成分,通過SuperPred預測化學成分的靶點,通過TTD、OMIM、PharmGKB、DigSee獲得胃癌相關基因,通過STRING獲得蛋白質(zhì)相互作用信息。運用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物-化合物靶點網(wǎng)絡”、“化合物靶點蛋白互作網(wǎng)絡”、“胃癌蛋白互作網(wǎng)絡”、“化合物靶點-胃癌靶點蛋白互作網(wǎng)絡”,并對網(wǎng)絡的關鍵拓撲參數(shù)進行分析。運用MCODE對網(wǎng)絡進行模塊分析,識別網(wǎng)絡中的核心聚類模塊。通過DAVID對模塊中的基因進行GO富集和KEGG通路富集分析。在白花蛇舌草治療結(jié)直腸癌作用機制的網(wǎng)絡藥理學研究中,通過TCMSP、TCMID、TCM Database@Taiwan獲得白花蛇舌草的化學成分,通過PharmMapper預測化學成分的靶點,通過DisGeNET獲得結(jié)直腸癌相關基因,通過STRING獲得蛋白質(zhì)相互作用信息。運用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物-化合物靶點網(wǎng)絡”、“結(jié)直腸癌蛋白互作網(wǎng)絡”、“化合物-結(jié)直腸癌靶點蛋白互作網(wǎng)絡”,對網(wǎng)絡的關鍵拓撲參數(shù)進行分析,確認白花蛇舌草治療結(jié)直腸癌的潛在核心靶點,通過DAVID對其進行GO富集和KEGG通路富集分析。研究結(jié)果1.胃腸道癌整合基因表達譜分析結(jié)果對9個胃癌芯片數(shù)據(jù)集進行整合分析,得到411個差異基因,對TCGA胃癌測序數(shù)據(jù)進行分析,得到4623個差異基因,對這些差異基因取交集,最終共得到268個共同差異基因(149個下調(diào)基因,119個上調(diào)基因)。蛋白互作網(wǎng)絡和模塊分析得到3個核心聚類模塊和9個核心基因(TOP2A、COL1A1、COL1A2、COL3A1、NDC80、CDKN3、CEP55、TPX2、TIMP1)。功能富集分析顯示,下調(diào)基因主要參與多種代謝過程,包括異生素、輔助因子、維生素、氨基酸、碳水化合物等的代謝,上調(diào)基因主要富集在癌癥相關通路,如ECM-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體信號通路等。生存分析得到9個基因構(gòu)建預后模型,3個基因(COL8A1、SMPD3、PLEKHS1)與胃癌患者生存時間呈正相關,6個基因(CST2、AADAC、SERPINE1、ASPN、ITGBL1、MAP7D2)與胃癌患者生存時間呈負相關。對6個結(jié)直腸癌芯片數(shù)據(jù)集進行整合分析,得到990個差異基因,對TCGA結(jié)腸癌測序數(shù)據(jù)進行分析,得到4131個差異基因,對這些差異基因取交集,最終共得到885個共同差異基因(458個下調(diào)基因,427個上調(diào)基因)。GSEA富集分析顯示,有32條信號通路出現(xiàn)在3個或3個以上的數(shù)據(jù)集中,包括9條激活通路和23條抑制通路。生存分析得到7個基因構(gòu)建預后模型,5個基因(AXIN2、CXCL1、ITLN1、CPT2、CLDN23)與結(jié)直腸癌患者生存時間呈正相關,2個基因(TIMP1、LZTS3)與結(jié)直腸癌患者生存時間呈負相關。2.白花蛇舌草抗胃腸道癌作用機制的網(wǎng)絡藥理學分析結(jié)果在白花蛇舌草抗胃癌作用機制的網(wǎng)絡藥理學研究中,對“化合物-化合物靶點網(wǎng)絡”、“化合物靶點蛋白互作網(wǎng)絡”、“胃癌蛋白互作網(wǎng)絡”、“化合物靶點-胃癌靶點蛋白互作網(wǎng)絡”的綜合分析顯示,碳酸酐酶、p53、PIK3CA可能是白花蛇舌草的關鍵靶點,白花蛇舌草與細胞周期、細胞凋亡、血管新生相關的蛋白,如CDK2、p27Kip1、cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、p53、AKT1、BCL2、MAPK1、VEGFA、PIK3CA 等存在較強的聯(lián)系。GO富集和KEGG通路富集分析顯示,白花蛇舌草所調(diào)控的核心蛋白顯著富集在核苷酸切除修復、細胞凋亡、細胞周期、PI3K-Akt-mTOR信號通路、VEGF信號通路、Ras信號通路等生物學過程和信號通路。通過與胃癌整合基因表達譜分析中差異基因KEGG通路富集分析的結(jié)果進行綜合分析,發(fā)現(xiàn)二者共有的KEGG通路有5條,分別為細胞周期、PI3K-Akt信號通路、FoxO信號通路、粘著斑、TNF信號通路。在白花蛇舌草抗結(jié)直腸癌作用機制的網(wǎng)絡藥理學研究中,對“化合物-化合物靶點網(wǎng)絡”、“結(jié)直腸癌蛋白互作網(wǎng)絡”、“化合物-結(jié)直腸癌靶點蛋白互作網(wǎng)絡”的綜合分析得到白花蛇舌草作用于結(jié)直腸癌的10個潛在核心靶點,分別為HRAS、PIK3CA、KRAS、p53、APC、BRAF、GSK3B、CDK2、AKT1、RAF1。GO富集分析顯示,白花蛇舌草所調(diào)控的核心靶點顯著富集在肽基-絲氨酸磷酸化、ERBB2信號通路、Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導等生物過程。KEGG通路富集分析顯示,白花蛇舌草所調(diào)控的核心靶點主要參與結(jié)直腸癌、癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等信號通路。通過與結(jié)直腸癌整合基因表達譜分析中GSEA富集分析的結(jié)果進行綜合分析,發(fā)現(xiàn)二者共有的KEGG通路有4條,分別為MAPK信號通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)、Rap1信號通路、胰島素信號通路。研究結(jié)論本研究綜合運用網(wǎng)絡藥理學和整合基因表達譜分析方法,在系統(tǒng)層面揭示了白花蛇舌草抗胃腸道癌的活性成分、作用靶點和信號通路,初步闡釋了白花蛇舌草抗胃癌的作用機制可能與其協(xié)同調(diào)節(jié)與胃癌的主要病理過程如細胞凋亡抵抗、細胞周期失調(diào)、細胞分化異常、細胞增殖失控、細胞遷移、細胞侵襲、血管新生等密切相關的信號通路有關,白花蛇舌草抗結(jié)直腸癌的作用機制可能與其協(xié)同調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌中多個常見突變基因的表達有關。本研究有助于為理解、評價中醫(yī)藥在治療復雜疾病中的協(xié)同作用及促進網(wǎng)絡藥理學方法在探索抗癌中藥潛在作用機制中的應用提供線索和思路。然而,由于本研究是基于數(shù)據(jù)分析開展的,因此需要進一步的生物學實驗來驗證本研究的結(jié)果。
【學位單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

本研宄納入的９個胃癌芯片數(shù)據(jù)集基本信息如表１所示。首先，通過ＲＲＡ方法對??９個芯片數(shù)據(jù)集進行整合分析，得到４１１個差異表達基因，包括２３４個下調(diào)基因和１７７??個上調(diào)基因（圖２Ａ）。其次，對ＴＣＧＡ胃癌測序數(shù)據(jù)進行分析，得到４６２３個差異表達??基因，包括２２１９個下調(diào)基因和２４０４個上調(diào)基因。最后，對這些差異基因取交集，最終??共得到２６８個共同差異基因，包括１４９個下調(diào)基因和１１９個上調(diào)基因（圖２Ｂ，圖２Ｃ，??表２）。??４１??

基于網(wǎng)絡藥理學的白花蛇舌草治療胃腸道癌作用機制研宄??３．２功能富集分析??ＧＯ富集分析顯示，下調(diào)的差異基因顯著富集在多種與代謝相關的生物過程，而上??調(diào)的差異基因與細胞外基質(zhì)密切相關，如細胞外基質(zhì)組織、細胞外基質(zhì)分解、細胞外基??質(zhì)結(jié)構(gòu)成分等（圖３Ａ）。??ＫＥＧＧ通路富集分析顯示，下調(diào)的差異基因顯著富集在多種與代謝相關的信號通路，??如藥物代謝－細胞色素Ｐ４５０、細胞色素Ｐ４５０異生素代謝、視黃醇代謝、酪氨酸代謝等，??而上調(diào)的差異基因顯著富集在與環(huán)境信息處理和腫瘤演進相關的通路，如細胞因子－細??胞因子受體相互作用、ＥＣＭ－受體相互作用、粘著斑等（圖３Ｂ）。??Ａ?Ｂ??

ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ?ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ?ｆａｃｔｏｒ，ＴＰＸ２?）、ＴＩＭＰ?基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑?１?（?ＴＩＭＰ??ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?１，ＴＩＭＰ１）（表?３）。此外，通過?ＭＣＯＤＥ?對蛋白互作網(wǎng)絡進行??模塊分析，篩選打分值最高的前３個模塊作為該網(wǎng)絡的核心聚類模塊（圖４Ｂ，４Ｃ，４Ｄ）。??本研究發(fā)現(xiàn)，除了?ＣＸＣＬ８之外其余９個潛在核心基因都出現(xiàn)在這３個核心聚類模塊中，??這意味著這３個模塊在很大程度上代表了該蛋白互作網(wǎng)絡的關鍵生物特征，同時這９個??基因被確認為該蛋白互作網(wǎng)絡的核心基因（圖５）。??ＧＯ富集分析顯示，模塊１與有絲分裂核分裂、細胞分裂、有絲分裂胞質(zhì)分裂、中??間體、中心體、細胞核密切相關；模塊２與膠原分解代謝過程、膠原纖維組織、細胞外??基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、血小板衍生生長因子結(jié)合、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、膠原三聚體密切相關；模塊３與??細胞外基質(zhì)分解、細胞外區(qū)域、細胞外空間密切相關（圖６Ａ）。ＫＥＧＧ通路富集分析顯??示，模塊１中的基因顯著富集在Ｐ５３信號通路、細胞周期、ＦｏｘＯ信號通路；模塊２中??的基因顯著富集在ＥＣＭ－受體相互作用、粘著斑、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ信號通路；模塊３中的基因??顯著富集在Ｔｏｌｌ樣受體信號通路、ＴＮＦ信號通路（圖６Ｂ）。本研究的數(shù)據(jù)顯示，某些差??異基因的過表達可能會影響它們所參與的信號通路中的正常調(diào)控。例如，胃癌組織中過??表達的Ｃ０Ｌ１Ａ２、Ｃ０Ｌ１Ａ１、Ｃ０Ｌ４Ａ１可能會導致ＥＣＭ－受體相互作用、粘著斑、ＰＩ３Ｋ－??Ａｋｔ信號通路的失調(diào)，而ＳＰＰ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９的過表達可能會導致Ｔｏｌｌ樣受體信號??通路的失調(diào)。此外

本文編號：2865362