目的:觀察雷公藤甲素(TP)對體外正常永生化足細胞和動物體內(nèi)正常足細胞的直接作用,探討其中的機制及其臨床意義。方法:體外實驗采用人源永生化足細胞,不同劑量梯度(10 ng/ml、30 ng/ml、50ng/ml)雷公藤甲素處理足細胞,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及死細胞數(shù)量的變化;采用Annexin V流式細胞分析檢測細胞凋亡情況;采用western blot檢測MAPK p38、P53、Bax、caspase3等分子的活化或表達水平的變化。同時不同劑量梯度地塞米松(1μmol、10μmol、100μmol)處理足細胞,qPCR檢測,對比TP與地塞米松對部分足細胞共同表達的標志性基因,包括CD2AP、SYNPO、NPHS2、VEGFA、WT1和一些我們前期工作已驗證的基因,如ENPEP、PAK1、FGFR1、GADD45A、CERS6、ZNF277、TSC22D1、SEPT10的轉(zhuǎn)錄水平的影響。同時用TP和地塞米松共同處理,檢測上述情況,觀察糖皮質(zhì)激素是否可以逆轉(zhuǎn)TP對足細胞的作用。體內(nèi)實驗TP(100~600μg/kg/day)腹腔注射小鼠28天,期間收集每周尿液,用銀染檢測蛋白尿情況;注射結(jié)束后取腎皮質(zhì)采用電鏡、PAS染色光鏡、冰凍切片免疫熒光,檢測腎小球以及足細胞的病理變化;取血,檢測腎功能相關(guān)指標的改變情況;同時提取腎小球用qPCR檢測足細胞重要基因的表達情況。提取大鼠腎小球體外培養(yǎng),給予TP(30 ng/ml)處理24h,qPCR檢測足細胞重要基因表達情況。結(jié)果:文獻中常用的保護足細胞的TP濃度(10 ng/ml)就足以激活永生化足細胞中MAPK p38、p53、BAX等促凋亡信號,并能誘導細胞凋亡,而更高濃度的TP其損傷作用更明顯,并且TP使得足細胞結(jié)構(gòu)和功能所必需的基因表達顯著下調(diào)。相反,糖皮質(zhì)激素即使在高濃度的情況下對永生化足細胞無毒性作用。此外,TP誘導的足細胞凋亡、促凋亡信號激活、以及足細胞重要基因的下調(diào)均不能被糖皮質(zhì)激素逆轉(zhuǎn)。動物實驗顯示高劑量TP長期注射小鼠不能引起足細胞病理損傷,同時未出現(xiàn)足細胞必需基因的下調(diào)和蛋白尿的產(chǎn)生;最后,我們發(fā)現(xiàn)TP對離體培養(yǎng)的腎小球中的足細胞重要基因無下調(diào)作用,即對離體培養(yǎng)的腎小球中的足細胞無毒性作用。結(jié)論:TP對體外培養(yǎng)的永生化足細胞有毒性作用,但對體內(nèi)足細胞和離體腎小球內(nèi)的足細胞無毒性作用。我們的研究表明,(1)永生的足細胞可能在遺傳上進化成對TP毒性敏感的細胞,因此在解讀來自永生化足細胞的實驗數(shù)據(jù)時應謹慎;(2)TP用于治療各種疾病時不會對足細胞產(chǎn)生損傷;(3)由于TP誘導的足細胞損傷不能被激素逆轉(zhuǎn),TP可能成為激素抵抗型足細胞病分子機制研究的獨特體外模型。
【學位單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

結(jié)果與分析.TP 導致體外培養(yǎng)的永生化足細胞損傷既往研究一般使用 10 ng/ml 用于足細胞損傷模型中的 TP 保護劑量[8-10]，為不同濃度的 TP 對培養(yǎng)的正常永生化足細胞的作用，我們分別采用三種濃度（g/ml、30 ng/ml、50 ng/ml）的 TP 處理足細胞，并分別處理 24h 和 48h，顯微觀察細胞形態(tài)、細胞死亡情況、貼壁細胞密度等。我們發(fā)現(xiàn) TP 處理后足細態(tài)受損，漂浮的死亡細胞增多，并且隨著 TP 的劑量越大，處理時間越長，胞死亡越多，貼壁細胞密度下降，并呈劑量和時間依賴性改變（圖 1）。

P 處理細胞 24h 僅有凋亡增加的趨勢，并無統(tǒng)計學差異，隨后 48h 凋亡顯著增統(tǒng)計學差異（圖 2.B）。已有文獻報道 MAPK p38 和 p53 均參與了足細胞的凋亡[14-17]，我們進行estern blot 檢測，結(jié)果顯示這三種不同濃度（10 ng/ml、30 ng/ml、50 ng/ml）P 均可激活足細胞中的 p38、p53 信號（圖 3.A，B），并且呈劑量依賴性，這式細胞儀檢測的結(jié)果相一致。此外，查閱文獻可知 BAX 介導 p53 誘導的細亡，因此我們檢測了 BAX 的蛋白水平表達情況，結(jié)果如預期所示，TP 可以 BAX 在足細胞中的蛋白表達水平（圖 3C），與 p53 的激活相一致。同時檢胞常見凋亡信號中的 caspase 3 發(fā)現(xiàn)，TP 未能激活足細胞中的 caspase 3 信號（），這表明 TP 誘導的足細胞凋亡可能通過獨立于 caspase 3 之外的通路方式。

TP 未能激活足細胞中的 caspase 3 信號（圖3D），這表明 TP 誘導的足細胞凋亡可能通過獨立于 caspase 3 之外的通路方式進行。圖 2：TP 誘導培養(yǎng)的永生化足細胞凋亡Annexin V-FITC/PI 染色和流式細胞術(shù)，A. 30 ng/ml 的 TP 處理足細胞的 Annexin V 流式代表性柱狀圖。B.10 ng/mlTP 也可以明顯誘導培養(yǎng)的足細胞凋亡。NC（空白正常對照組）。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。所有數(shù)據(jù)均代表三個獨立實驗的結(jié)果。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 傅強;江振洲;張陸勇;;Impairment of Triptolide on Liver Mitochondria in Isolated Liver Mitochondria and HL7702 Cell Line[J];Chinese Journal of Integrative Medicine;2013年09期

本文編號：2864115