目的:研究柚皮素(NAR)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的神經(jīng)保護(hù)作用方法:在體實(shí)驗(yàn)中,SD大鼠隨機(jī)分為5個(gè)組(n=6),包括空白組,NAR(100mg/kg)組,LPS(5μg)組,LPS+NAR(50 mg/kg)組和LPS+NAR(100 mg/kg)組。單側(cè)中腦黑質(zhì)注射LPS(5μg)誘導(dǎo)DA神經(jīng)元損傷模型。造模后大鼠連續(xù)灌胃給藥7天,轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的運(yùn)動(dòng)能力,免疫熒光和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TH,IBA-1,NLRP3和caspase-1蛋白變化。離體實(shí)驗(yàn)中,BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,隨機(jī)分為5個(gè)組,空白組,NAR(100μM)組,LPS(1μg/ml)組,LPS+NAR(10μM)組,LPS+NAR(100μM)組。NAR預(yù)處理1 h后加入LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。24 h后,Griess試劑盒和ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中炎癥因子(NO,IL-1β和IL-18)的釋放,免疫熒光和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IBA-1、NLRP3和caspase-1蛋白變化。使用si RNA NLRP3轉(zhuǎn)染技術(shù),檢測(cè)NLRP3蛋白的沉默率后,觀察柚皮素對(duì)于LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞激活的影響。BV-2和MN9D細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),將BV-2細(xì)胞和MN9D細(xì)胞均分為10個(gè)組,NAR預(yù)處理1 h后加入LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞的激活。24 h后,轉(zhuǎn)移BV-2上清至MN9D細(xì)胞中,繼續(xù)培養(yǎng),24 h后,MTT方法檢測(cè)MN9D細(xì)胞的活性,Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MN9D細(xì)胞的TH蛋白變化。結(jié)果:在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中,模型組大鼠在棒時(shí)間比空白組減少,給予高劑量(100 mg/kg)柚皮素,大鼠在棒時(shí)間顯著增加;免疫熒光和Western Blot結(jié)果顯示,模型組DA神經(jīng)元數(shù)量減少,小膠質(zhì)細(xì)胞激活,NLRP3炎癥小體表達(dá)增加,給予高劑量(100 mg/kg)柚皮素,DA神經(jīng)元數(shù)量增加,小膠質(zhì)細(xì)胞激活減少,NLRP3炎癥小體表達(dá)減少。離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白組比較,LPS可以引起B(yǎng)V-2細(xì)胞上清中炎癥因子(NO、IL-1β和IL-18)的釋放增加,IBA-1蛋白表達(dá)增加,NLRP3炎癥小體表達(dá)增加,給予高劑量(100μM)柚皮素,上清中炎癥因子釋放減少,IBA-1蛋白表達(dá)減少,NLRP3炎癥小體表達(dá)增加減少。并且si RNA NLRP3轉(zhuǎn)染后,柚皮素對(duì)于BV-2細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用消失。BV-2和MN9D細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:LPS刺激的BV-2細(xì)胞上清可以引起MN9D細(xì)胞的損傷,TH蛋白表達(dá)降低,給予高劑量(100μM)柚皮素,MN9D細(xì)胞的活性增加,TH蛋白表達(dá)增加。并且在si RNA NLRP3轉(zhuǎn)染后,柚皮素對(duì)MN9D細(xì)胞的保護(hù)作用消失。結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)中,柚皮素可以通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活,對(duì)LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1 柚皮素減輕 LPS 對(duì) DA 神經(jīng)元的損傷。A.大鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)時(shí)間統(tǒng)計(jì)；B.大鼠中腦免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)；C.大鼠中腦 DA 神經(jīng)元數(shù)量；D.WesternBlot 檢測(cè)大鼠中腦 TH 蛋白表達(dá)。（ x± SEM, n = 6），與空白組相比，*P < 0.05；與模型組相比，#P < 0.05。Fig.1 NAR attenuated LPS-induced DA neuronal loss in vivo. (A). The time rat stayed on the rodwas recorded. (B). DA neuronal counting by double-immunofluorescence staining with an anti-THantibody（blue）and anti-OX-42 antibody (red). (C). The number of SN TH-positive neurons wascounted and TH protein expression was detected by western blot assay (D). Data were expressed asa percentage of the control group and were the mean ±SEM from six rats. *P < 0.05 compared withcontrol group; #P < 0.05 compared with LPS group.2.2 柚皮素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中 NLRP3 炎癥小體的激活在 SD 大鼠實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步驗(yàn)證柚皮素對(duì)于 LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及NLRP3 的影響。大鼠中腦免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示：紅色熒光代表小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白（OX-42），綠色熒光代表 NLRP3 蛋白，從光密度測(cè)定的結(jié)果可以看出：與空

BC圖2 柚皮素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活。A.OX-42和NLRP3免疫熒光雙標(biāo)；B. OX-42 和 NLRP3 的光密度檢測(cè)；C.Western Blot 檢測(cè)大鼠中腦 IBA-1、NLRP3 和 caspase-050100150200250*#LPS - - + + +NAR (mg/kg)

與模型組比較，給予高劑量（100μM）柚皮素，NLRP3 和 caspase-1 蛋白表達(dá)降低（圖4B）。A B圖 4 柚皮素抑制 LPS 誘導(dǎo)的 NLRP3 炎癥小體的激活。A.免疫熒光檢測(cè) NLRP3 蛋白；B.Western Blot 檢測(cè) NLRP3、caspase-1 蛋白表達(dá)。（ x±SEM,n=3）, 與空白組相比，*P<0.05；
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