目的:1.篩選去卵巢大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織中差異表達(dá)的mRNA和lncRNA并進(jìn)行功能性分析和生物信息學(xué)分析,探討其在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中潛在作用;2.研究差異表達(dá)的mRNA富集的通路在去卵巢大鼠中的變化及骨疏康的調(diào)控作用;3.研究差異表達(dá)的lncRNA的靶基因及相關(guān)通路在去卵巢大鼠中的變化及骨疏康的調(diào)控作用。方法:1.去卵巢大鼠股骨mRNA和lncRNA表達(dá)譜研究24只6月齡SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham,12只)和模型組(OVX,12只)。通過去卵巢法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型,以假手術(shù)大鼠作為對照,取兩組大鼠的股骨遠(yuǎn)端骨組織進(jìn)行高通量測序,建立股骨遠(yuǎn)端骨組織中mRNA和lncRNA的表達(dá)譜并進(jìn)行差異性分析,然后采用Real-time PCR對差異表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證,驗(yàn)證測序結(jié)果的可靠性,最后對差異表達(dá)的mRNA和lncRNA進(jìn)行功能性分析和生物信息學(xué)分析,以探討這些差異表達(dá)的mRNA和lncRNA在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中潛在作用。2.骨疏康抑制去卵巢大鼠骨細(xì)胞凋亡,激活BMP-2/Smads信號通路(1)骨疏康對去卵巢大鼠的骨保護(hù)作用48只6月齡SD大鼠隨機(jī)分為4組,每組12只:假手術(shù)組(sham組),模型組(OVX組),骨疏康組(GSK組),阿侖膦酸鈉組(ALN組)。建立去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型,12周后進(jìn)行藥物干預(yù),給藥劑量按照人與大鼠體表面積折算,GSK組給藥劑量為0.27g/kg,ALN組給藥劑量為1.02mg/kg,sham組和OVX組分別給予等體積生理鹽水灌胃。藥物干預(yù)12周后取材,進(jìn)行各項指標(biāo)的檢測:①麻醉后檢測大鼠全身骨密度和腰椎骨密度,②檢測離體股骨骨密度,③股骨遠(yuǎn)端microCT掃描,④股骨遠(yuǎn)端HE染色。(2)骨疏康對去卵巢大鼠BMP2/Smads信號通路的影響取上述實(shí)驗(yàn)中大鼠,麻醉生效后,大鼠取仰臥位,大腿內(nèi)側(cè)入路去除肌肉組織,迅速分離雙側(cè)股骨,①左側(cè)股骨采用10%中性多聚甲醛固定24小時,進(jìn)行ALP染色、Trap染色,②右側(cè)股骨采用液氮凍存,提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá),提取總蛋白和磷酸化的蛋白,采用western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。(3)去卵巢大鼠骨組織中骨細(xì)胞凋亡情況及骨疏康的干預(yù)作用取上述實(shí)驗(yàn)中大鼠左側(cè)股骨,進(jìn)行TUNEL染色;取右側(cè)股骨提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá),提取總蛋白進(jìn)行western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.去卵巢大鼠股骨mRNA和lncRNA表達(dá)譜研究(1)去卵巢大鼠動物模型的建立兩組大鼠造模12周后進(jìn)行骨密度檢測,與sham組相比,OVX組大鼠全身骨密度和腰椎骨密度均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。對離體股骨的骨密度檢測和microCT掃描發(fā)現(xiàn),與sham組相比,OVX組離體股骨的整體骨密度和股骨頭、股骨近端、股骨干、股骨遠(yuǎn)端骨密度水平均顯著降低(P0.05)。對于microCT檢測結(jié)果,與sham組相比,OVX組中BV/TV,BS/TV和Tb.N的水平顯著降低,而Tb.Sp水平明顯增加(P0.05),兩組間Tb.Th比較雖然無統(tǒng)計學(xué)差異,但OVX組Tb.Th水平有下降趨勢。HE染色結(jié)果顯示,與sham組相比,OVX組骨小梁變薄,骨小梁數(shù)量明顯減少,排列稀疏,骨小梁間隙相對較寬,這與microCT的三維圖像相一致。這些結(jié)果表明,與sham組相比,OVX大鼠股骨的骨量明顯減少,股骨遠(yuǎn)端的骨微結(jié)構(gòu)明顯變差。(2)轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)分析對兩組骨組織樣本進(jìn)行高通量測序和轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)440條mRNA存在組間差異表達(dá),其中160條上調(diào)和280條下調(diào),17條lncRNA存在組間差異表達(dá),其中9條上調(diào)和8條下調(diào),21條TUCP存在組間差異,其中11條上調(diào)和10條下調(diào)。對差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)所富集到的信號通路主要包括破骨細(xì)胞分化,抗原處理和呈現(xiàn),Hippo信號通路,雌激素信號通路,吞噬,RNA轉(zhuǎn)運(yùn),核糖體,泛素介導(dǎo)的蛋白水解,mTOR信號通路等,對lncRNA和TUCP進(jìn)行靶基因預(yù)測,發(fā)現(xiàn)多個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本預(yù)測到BMP家族,對所有靶基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),lncRNA和TUCP對核糖體途徑,胞吞作用,粘蛋白型O-聚糖生物合成,長期抑郁,FcγR介導(dǎo)的吞噬作用,甲狀腺激素信號通路,血管平滑肌收縮,神經(jīng)活性配體-受體相互作用,細(xì)胞溶質(zhì)DNA傳感途徑,RIG-I樣受體信號通路,TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等信號通路均有調(diào)節(jié)作用。2.骨疏康抑制去卵巢大鼠骨細(xì)胞凋亡,激活BMP-2/Smads信號通路實(shí)驗(yàn)過程中,因各種意外死亡6只大鼠,最終納入研究的實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量為42只。(1)骨疏康對去卵巢大鼠的骨保護(hù)作用①對各組大鼠進(jìn)行骨密度測定,發(fā)現(xiàn)與sham組相比,OVX組大鼠全身骨密度和腰椎骨密度均明顯減低(P0.05);與OVX組相比,GSK組和ALN組大鼠全身骨密度和腰椎骨密度均明顯升高(P0.05)。②對離體股骨的骨密度檢測發(fā)現(xiàn),OVX組股骨頭,股骨近端,股骨干,股骨遠(yuǎn)端和股骨整體的骨密度水平均顯著低于sham組(P0.05)。在GSK組和ALN組中,股骨頭股骨,股骨近端,股骨干,股骨遠(yuǎn)端和股骨整體的骨密度水平均顯著高于OVX組(P0.05)。其中,GSK組股骨遠(yuǎn)端的骨密度水平高于ALN組,盡管沒有統(tǒng)計學(xué)差異。③對股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行microCT掃描,發(fā)現(xiàn)與sham組相比,OVX組BV/TV,BS/TV,Tb.Th和Tb.N的水平顯著降低,而Tb.Sp水平增加(P0.05)。GSK和ALN組中Tb.Sp水平顯著降低,而其他參數(shù)水平則增加(P0.05)。而且,GSK和ALN組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。這些數(shù)據(jù)表明GSK和ALN都能夠增加骨小梁體積。④對股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行HE染色,發(fā)現(xiàn)OVX組骨小梁變薄,斷裂,骨小梁數(shù)量減少,骨小梁間隙增寬,而GSK組和ALN組骨小梁相對較厚實(shí),連接較多,骨小梁間隙變窄。對比microCT的三維重建圖發(fā)現(xiàn),股骨骨小梁結(jié)構(gòu)的變化與HE染色顯示的組織學(xué)變化一致。(2)骨疏康對去卵巢大鼠BMP2/Smads信號通路的影響①ALP染色和Trap染色發(fā)現(xiàn),OVX組骨小梁上ALP陽性成骨細(xì)胞數(shù)量減少,染色較淺,呈灰色甚至灰白色,TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量增加,酒紅色染色明顯甚至融合成片,主要位于骨小梁邊緣。與OVX組相比,GSK組ALP陽性成骨細(xì)胞染色變深,破骨細(xì)胞數(shù)量變少,染色呈淺紅色。②進(jìn)行qRT-PCR檢測分析發(fā)現(xiàn),與sham組相比,OVX組中BMP-2,Osterix和Runx2的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。而Smadl和Smad5基因沒有明顯變化。有趣的是,GSK治療可引起B(yǎng)MP-2,Osterix和Runx2 mRNA水平的明顯上調(diào),而ALN組只有Runx2mRNA 水平上調(diào)(P0.05)。③進(jìn)行western blot檢測分析發(fā)現(xiàn),與sham組相比,OVX組的BMP-2,Smadl,p-Smadl,p-Smad5和Runx2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平下調(diào)(P0.05),Smad5和Osterix有下降趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異,這說明在去卵巢大鼠模型中,BMP-2/Smads信號通路受到抑制。與 0VX 組相比,GSK 組 BMP-2,p-Smadl,p-Smad5,Osterix 和 Runx2 的蛋白表達(dá)水平均升高(P0.05)。ALN組BMP-2,p-Smadl,Osterix和Runx2的表達(dá)水平升高(P0.05)。(3)去卵巢大鼠骨組織中骨細(xì)胞凋亡情況及骨疏康的干預(yù)作用①TUNEL染色和凋亡率的測定提示,OVX組具有更多的TUNEL陽性骨細(xì)胞,與OVX組相比,GSK組TUNEL陽性骨細(xì)胞顯著減少(P0.05)②通過qRT-PCR檢測基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),與sham組相比,OVX組Bcl-xL基因的表達(dá)水平降低(P0.05),Bak水平升高(P0.05),Bcl-2表達(dá)水平有所降低,但缺乏統(tǒng)計學(xué)意義。與OVX組相比,GSK組Bcl-xL的基因水平顯著增加,Bak水平顯著降低(PO.05)。③通過Western blot檢測蛋白水平發(fā)現(xiàn),與sham組相比,0VX組各蛋白水平與基因水平的檢測結(jié)果相符合。與OVX組相比,GSK組Bcl-xL蛋白水平升高,Bak蛋白水平降低(P0.05)。結(jié)論:1.去卵巢大鼠骨組織中存在440條差異表達(dá)的mRNA(160條上調(diào)和280條下調(diào)),其主要富集的通路與凋亡密切相關(guān)。2.去卵巢大鼠骨組織中存在差異表達(dá)的17條lncRNA(9條上調(diào)和8條下調(diào))和21條TUCP(11條上調(diào)和10條下調(diào)),對差異表達(dá)的lncRNA和TUCP的進(jìn)行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)多個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本預(yù)測到BMP家族。3.骨疏康可通過刺激BMP-2/Smads信號途徑的活化,降低骨細(xì)胞的凋亡率來改善去卵巢大鼠股骨的骨密度和骨微結(jié)構(gòu)特性。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

采用ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ?ｖｌ．?３．?１進(jìn)行新轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測。ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)流算法以及可??選的從頭組裝來組裝和定量代表每個基因座的多個剪接變體的全長轉(zhuǎn)錄物。設(shè)置不同??的篩選條件，篩選最終得到的ｌｎｃＲＮＡ進(jìn)行后續(xù)分析，篩選流程如圖１所示：??＾???０４——ＫＢ??圖１篩選流程圖??在進(jìn)行篩選之前，首先使用Ｃｕｆｆ＇ｍｅｒｇｅ軟件對各樣品拼接得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行合并，并??去掉其中鏈方向不確定的轉(zhuǎn)錄本，得到本次測序完整的轉(zhuǎn)錄組信息。之后，對合并的??轉(zhuǎn)錄本集合按照圖１進(jìn)行ｌｎｃＲＮＡ的篩選，其中對于ｓｔｅｐ５，取沒有編碼潛能的轉(zhuǎn)錄本??的交集作為本次分析預(yù)測得到的ＩｎｃＲＮＡ數(shù)據(jù)集，取至少被一種編碼潛能預(yù)測軟件認(rèn)??為有編碼潛能的轉(zhuǎn)錄本作為本次分析的ＴＵＣＰ?（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ?ｏｆ?ｕｎｃｅｒｔａｉｎ?ｃｏｄｉｎｇ??ｐｏｔｅｎｔｉａｌ），這些轉(zhuǎn)錄本中可能包含一部分具有一定編碼潛能的ＩｎｃＲＮＡ，因此我們將??它們作為單獨(dú)的一類轉(zhuǎn)錄本納入到后續(xù)的分析［｜７１］。本次分析采用ＣＮＣＩ??（Ｃｏｄｉｎｇ－Ｎｏｎ－Ｃｏｄｉｎｇ－Ｉｎｄｅｘ）?（ｖ２）分析工具［１＜」、ＣＰＣ?（Ｃｏｄｉｎｇ?Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ?Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）??（０．９－ｒ２）分析工具［１７３］和?Ｐｆａｍ?Ｓｃａｎ?（ｖｌ．?３）?Ｕ７４’１７Ｓ］分析工具。??（４）

統(tǒng)計學(xué)差異，但０ＶＸ組Ｔｂ．Ｓｐ水平有增高趨勢、Ｔｂ．Ｔｈ水平有下降趨勢（表１０）。ＨＥ??染色結(jié)果顯示，與ｓｈａｍ組相比，０ＶＸ組骨小梁變薄，骨小梁數(shù)量明顯減少，排列稀疏，??骨小梁間隙相對較寬，這與ｍｉｃｒｏＣＴ的三維圖像相一致（圖２）。這些結(jié)果表明，與??ｓｈａｍ組相比，０ＶＸ大鼠股骨的骨量明顯減少，股骨遠(yuǎn)端的骨微結(jié)構(gòu)明顯變差。??表９去卵巢大鼠離體股骨骨密度＿（ｇ／ｃｍ２）??組別ｎ?股骨全段?股骨頭?股骨近端?股骨干?股骨遠(yuǎn)端??ｓｈａｍ?組?１２?０．３３６２±０．?００７０?〇．２７８９±０．?００９７?〇．３８１１±０．?０２２４５?〇．３４５４±０．?０２９１?０？?３３５７±０．?０１２９??０ＶＸ?組?１２?０．２８３０±０．?０２２４＊?〇．２４７９±０．?０１８６＊?〇．３０７７±０．?０３０９＊?〇．２７８４±０．?０１９９＊?０■?２９５９±０．?０４０８＊??Ｚ?（ｔ）?－３．３１７?３．７８０?５．?１０１?５．６４８?－２．０１０??Ｐ?０．００１?０．００２?〇．〇〇〇?０．?〇〇〇?０．０４４??注：＇?與ｓｈａｍ組相比，／＞＜０．?０５。??表１０去卵巢大鼠股骨遠(yuǎn)端骨微結(jié)構(gòu)??￣ｍ＼＼?ｎ?ＢＶ／ＴＶ?（％）?ＢＳ／ＴＶ?（１／ｉｎｍ）?Ｔｂ．Ｔｈ?（ｍｍ）￣Ｔｂ．?Ｎ?（１／ｍｍ）?Ｔｂ．Ｓｐ?（ｍｍ）??２３??

㈡高通量測序數(shù)據(jù)分析??Ｉ．骨組織總ＲＮＡ質(zhì)量檢測??１０個骨組織的總ＲＮＡ樣本采用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，結(jié)果如圖３Ａ所??示，各樣本的電泳條帶明亮、邊緣清晰，均可明顯看到２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ共３個條帶，??除５Ｆ、６Ｆ、８Ｆ樣本外，其他樣本均可見到２８Ｓ條帶亮度明顯強(qiáng)于１８Ｓ條帶。對５Ｆ、??６Ｆ、８Ｆ號骨組織重新進(jìn)行總ＲＮＡ抽提，進(jìn)行完整性檢測，如圖３Ｂ示２８Ｓ條帶亮度明??顯強(qiáng)于１８Ｓ條帶，初步說明抽提的總ＲＮＡ樣本完整性較高，無明顯降解。??２４??
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本文編號：2851981