發(fā)布時(shí)間：2020-10-19 08:22

　　 目的:青錢柳為胡桃科青錢柳屬青錢柳種植物(拉丁名:Cyclocarya palaurus.(Batal.)Ijinskaja),已有研究報(bào)道青錢柳葉具有調(diào)節(jié)血糖、降血脂、抗氧化等多種保健功效。《中國(guó)中藥資源志要》中記載,青錢柳葉具清熱消渴解毒之效,對(duì)糖尿病有一定的療效,但目前青錢柳的降糖物質(zhì)基礎(chǔ)還缺乏深入系統(tǒng)的研究,不利于青錢柳的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用。鑒于此,本課題從整體動(dòng)物、體外模型、化學(xué)成分三個(gè)方面,開(kāi)展青錢柳對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠的體內(nèi)外保護(hù)作用機(jī)制及其化學(xué)成分研究,從而闡明青錢柳活性部位改善Ⅱ型糖尿病的作用機(jī)制,明確青錢柳的降糖活性成分,為以后青錢柳的降糖物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法:1、青錢柳對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠降糖作用的機(jī)制研究采用高脂飼料喂養(yǎng),結(jié)合腹腔注射低劑量STZ的方法誘發(fā)Ⅱ型糖尿病大鼠模型的發(fā)生。分別給予二甲雙胍馬來(lái)酸羅格列酮陽(yáng)性藥(200mg/kg),低劑量(1.5g/kg)、中劑量(3g/kg)、高劑量(6g/kg)貴州產(chǎn)青錢柳水提液進(jìn)行干預(yù)治療,持續(xù)定時(shí)給藥12w。在給藥2、4、8、12w后,分別取尾靜脈血測(cè)定各組大鼠的空腹血糖值。給藥12w后,檢測(cè)各組大鼠末次空腹血糖值及葡萄糖耐量,并檢測(cè)大鼠血清中GSP、TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。包埋切片各組大鼠的胰腺組織和肝臟組織并進(jìn)行HE染色等處理,鏡檢并分析組織病理形態(tài)。2、青錢柳化學(xué)成分的研究以原兒茶酸、異槲皮苷、槲皮素、山奈酚、齊墩果酸、熊果酸為青錢柳的質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分。采用Thermo Syncronis C_(18)柱(5μm,250mm×4.6mm),流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%磷酸水(B),進(jìn)行梯度洗脫;流速1mL/min,柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)分別為260nm、360 nm、210nm等色譜條件,建立HPLC波長(zhǎng)切換法對(duì)不同青錢柳中上述成分進(jìn)行分析,同時(shí)采用比色法對(duì)其總多糖進(jìn)行定量測(cè)定,以判斷貴州產(chǎn)青錢柳的質(zhì)量。采用大孔吸附樹(shù)脂柱色譜法分離青錢柳各極性洗脫部位,運(yùn)用HPLC法明確各部位的分離情況,并用紫外分光光度法測(cè)定各洗脫部位的總黃酮和總皂苷含量。將進(jìn)一步分離出的不同洗脫部位進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶抑制作用研究,以篩選降糖活性部位。3、青錢柳降糖活性部位的質(zhì)譜分析研究為了明確青錢柳降糖活性部位的化學(xué)成分,研究運(yùn)用四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜法(Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS),采用色譜柱Thermo Accucore C_(18)柱(2.6μm,100mm×2.1mm);流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)進(jìn)行梯度洗脫;流速為0.3mL/min,柱溫35℃;質(zhì)譜離子源為ESI源,檢測(cè)模式為正模式和負(fù)模式;掃描模式為Full MS/dd-MS2,掃描范圍m/z 200~1600,MS/MS模式時(shí)碰撞能為NCE 20eV、40eV和60eV等條件,對(duì)青錢柳經(jīng)體外篩選降糖作用較優(yōu)的乙酸乙酯部位60%乙醇洗脫液的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。通過(guò)對(duì)各個(gè)色譜峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析,對(duì)比已知化合物的裂解規(guī)律,綜合保留時(shí)間、MS數(shù)據(jù)及參考文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)對(duì)各個(gè)色譜峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。同時(shí)運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜法(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS),條件采用5HP石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm,0.2μm),載氣流量為0.9mL/min,氣化室溫度280℃,進(jìn)行梯度升溫;質(zhì)譜離子源為EI,離子源溫度250℃;電子能量70eV,掃描范圍30~600m/z等條件,對(duì)在體外有一定降糖作用的青錢柳石油醚部位進(jìn)行定性分析,通過(guò)NIST標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)對(duì)各個(gè)色譜峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)解析。結(jié)果表明:1、貴州產(chǎn)青錢柳水提液有顯著的降糖作用,能明顯降低Ⅱ型糖尿病大鼠的空腹血糖,并增強(qiáng)其對(duì)葡萄糖的耐受能力,降低血液GSP和TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。HE染色切片顯示青錢柳干預(yù)組胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞較正常,肝索結(jié)構(gòu)得到修復(fù),證明青錢柳能抑制胰島細(xì)胞萎縮,改善胰島的損傷,降低肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的含量,改善肝的損傷。故推斷貴州產(chǎn)青錢柳的降糖作用機(jī)制主要可能有:修復(fù)受損的胰島β細(xì)胞和肝組織,促進(jìn)胰島素分泌同時(shí)避免胰島功能進(jìn)一步受損;改善機(jī)體脂代謝紊亂,抑制因糖化血清蛋白產(chǎn)生所導(dǎo)致的蛋白非功能化的惡性循環(huán)。2、建立了青錢柳化合物的HPLC定性和定量方法,絕大數(shù)青錢柳樣品中含有槲皮素和山奈酚,而多糖為青錢柳水提物中主要成分,三者可作青錢柳的指標(biāo)性成分。貴州產(chǎn)青錢柳中槲皮素(0.1232mg/g)、山奈酚(0.0883mg/g)和總多糖(70.11mg/g)的含量較于其它實(shí)驗(yàn)樣品高,屬于質(zhì)量較好。經(jīng)紫外分光光度法對(duì)青錢柳的各分離部位進(jìn)行分析,乙酸乙酯部位60%乙醇洗脫液的總黃酮和總皂苷含量很高分別為0.1118mg/mL和4.401mg/mL。進(jìn)一步的體外α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位60%乙醇洗脫液的抑制效果最佳,IC_(50)為20.40mg/mL。3、經(jīng)LC-MS/MS分析降糖活性成分聚集的乙酸乙酯部位60%乙醇洗脫液可能含有3個(gè)黃酮苷和19個(gè)三萜皂苷,如Rhamnazin、Kaempferitrin、cyclocarioside C、cyclocariosideⅡ、secodammara-25,26-dien-3-oic acid-24-O-D-xylopyranoside等化合物可能是青錢柳的主要降糖物質(zhì)。經(jīng)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)有一定降糖活性的青錢柳石油醚部以丁香酚和植物醇為主,還含有β-石竹烯、乙酸丁香酚酯、亞麻酸甲酯、新植二烯、鯊烯、β-欖香烯、α-姜黃烯等。青錢柳揮發(fā)部位以β-紫羅酮和β-谷甾醇為主。丁香酚、植物醇、β-紫羅酮及β-谷甾醇亦可作為青錢柳的活性成分。初步明確貴州產(chǎn)青錢柳降糖作用的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5;R284
【部分圖文】：

D E F圖 6 青錢柳水提液對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺組織的影響（HE，×200）A.正常對(duì)照組 B.模型組 C.陽(yáng)性組 D.青錢柳低劑量組 E.青錢柳中劑量組 F.青錢柳高劑量組2.3.7 青錢柳對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響結(jié)果如圖 7 所示，正常對(duì)照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核居于細(xì)胞中心，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞呈放射性規(guī)則排列，其內(nèi)無(wú)多余脂肪滴集群，模型組大鼠肝小葉界限模糊，其細(xì)胞索散亂分布，大部分干細(xì)胞尤其在小葉中央靜脈局部細(xì)胞出現(xiàn)較多的脂肪變性，視野下的胞漿內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量和大小不一的脂滴空泡[77]。陽(yáng)性藥組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)部分變形，其細(xì)胞索散亂分布和脂肪性病變[78]。與模型組相比，青錢柳低、中、高劑量組能不同程度上改善大鼠肝臟病理病變，特別是青錢柳高劑量組可明顯改善大鼠肝細(xì)胞損傷，肝細(xì)胞排列比較規(guī)則，無(wú)過(guò)多的脂肪聚集。說(shuō)明青錢柳可降低細(xì)胞內(nèi)脂肪含量，改善脂代謝紊亂，有一定的保肝作用。

D E F圖 7 青錢柳水提液對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠肝形態(tài)的影響（HE，×200）A.正常對(duì)照組 B.模型組 C.陽(yáng)性組 D.青錢柳低劑量組 E.青錢柳中劑量組 F.青錢柳高劑量組2.4 小結(jié)實(shí)驗(yàn)主要研究青錢柳水提液中有效成分對(duì)糖尿病合并高血脂模型大鼠血糖、血脂含量的影響，選取大鼠體重、糖耐量、糖化血清蛋白作為血糖檢測(cè)指標(biāo)[78]。貴州產(chǎn)青錢柳水提液能明顯降低Ⅱ型糖尿病大鼠的空腹血糖，并增強(qiáng)其對(duì)葡萄糖的耐受能力，結(jié)合對(duì)大鼠胰島的病理切片觀察，青錢柳能抑制胰島細(xì)胞萎縮，改善胰島的損傷，推斷青錢柳的主要降糖機(jī)制可能是其所含成分能修復(fù)受損的胰島 β 細(xì)胞，避免胰島 β 細(xì)胞進(jìn)一步損傷，并促使胰島分泌胰島素以達(dá)到降糖效果。青錢柳各組 GSP 均比陽(yáng)性組低，說(shuō)明青錢柳具有抑制因糖和蛋白質(zhì)的非酶促反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)非功能化，所產(chǎn)生的糖化血清蛋白又加速這一進(jìn)程發(fā)生的惡性循環(huán)，從而緩解Ⅱ型糖尿病癥狀的作用。臨床上認(rèn)為，過(guò)高的 TC、TG 和 LDL-C 會(huì)

26圖 8 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液與青錢柳乙酸乙酯部位 95%乙醇洗脫液于200nm-600nm 波長(zhǎng)掃描的吸收光譜圖 青錢柳各洗脫部位總皂苷的含量測(cè)定試劑制備5%香草醛冰乙酸溶液：稱取香草醛 0.5g，加入冰乙酸溶解并定容至 10。人參皂苷 Re 標(biāo)準(zhǔn)液：精密稱取人參皂苷 Re 對(duì)照品 2.0mg，加甲醇定L，得濃度為 0.2mg/mL 的人參皂苷 Re 標(biāo)準(zhǔn)液。樣品測(cè)定分別吸取乙酸乙酯部位 60%乙醇洗脫液 50μl、乙酸乙酯部位 95%乙醇洗l 和其它各洗脫部位 1.0mL 于蒸發(fā)皿中，60℃水浴揮干溶劑，冷卻至室溫 5%香草醛冰乙酸溶液 0.2mL 復(fù)溶殘?jiān)偌痈呗人?0.8mL，混勻后移入
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