結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,每年世界范圍內(nèi)死于結(jié)腸癌的患者約60萬。腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源,目前尚缺乏對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞干細(xì)胞體內(nèi)外殺傷作用及機(jī)理的系統(tǒng)性研究。中藥基于中醫(yī)理論治療,在臨床上應(yīng)用已久。基于此,本論文通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),系統(tǒng)地研究了結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞干細(xì)胞作為特異性抗原負(fù)載DC-CIK細(xì)胞和中藥槐耳顆粒及山藥提取物聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞體系對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞殺傷作用及機(jī)理。首先,利用磁珠分選方法分選HT29細(xì)胞系中CD133~+細(xì)胞,進(jìn)行克隆形成與裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,同一接種密度下,CD133~+細(xì)胞克隆形成率顯著高于CD133~-細(xì)胞,CD133~+細(xì)胞可致裸鼠成瘤。這些研究驗(yàn)證了CD133分子作為源自HT29細(xì)胞結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物的可行性。在上述CD133~+細(xì)胞作為結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的基礎(chǔ)上,制備了3種特異性抗原:(1)構(gòu)建含有CD133抗原表位AC133編碼序列的原核表達(dá)質(zhì)粒,獲得純化的AC133重組蛋白,證實(shí)能夠使小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答,繼而構(gòu)建了AC133慢病毒真核表達(dá)載體;(2)結(jié)腸癌干細(xì)胞總RNA提取物;(3)結(jié)腸癌干細(xì)胞全細(xì)胞裂解物。用上述3種結(jié)腸癌干細(xì)胞抗原分別負(fù)載DC-CIK細(xì)胞,體外殺傷HT29細(xì)胞及其干細(xì)胞,結(jié)果顯示3種體系細(xì)胞殺傷效果均強(qiáng)于無負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞和單獨(dú)的CIK細(xì)胞。此外,研究了中藥槐耳顆粒及山藥提取物對(duì)HT29細(xì)胞及其干細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果顯示,槐耳顆粒和山藥提取物均可抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖速率,使干細(xì)胞(CD133~+細(xì)胞)比例明顯降低。中藥槐耳顆粒及山藥提取物聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞對(duì)HT29細(xì)胞及其干細(xì)胞的殺傷作用強(qiáng)于單獨(dú)使用槐耳顆粒及山藥提取物。隨后,建立了結(jié)腸癌干細(xì)胞荷瘤裸鼠模型,進(jìn)行體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)及機(jī)理研究。結(jié)果表明,上述3種抗原負(fù)載DC-CIK細(xì)胞體系、中藥槐耳顆粒或山藥提取物聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞體系,及5-Fu聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞體系對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤效果強(qiáng)于單獨(dú)使用5-Fu、中藥槐耳顆粒或山藥提取物、無負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞;其發(fā)揮作用的機(jī)制主要包括CD4~+T、CD4~+T/CD8~+T和Th1型細(xì)胞因子升高,PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和Notch通路中的關(guān)鍵基因PI3KR1、Wnt1和Notch1的mRNA表達(dá)下調(diào),及Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)和Bax蛋白表達(dá)上調(diào),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。總之,本文通過體內(nèi)外試驗(yàn)聯(lián)合證明CD133可以作為源自HT29細(xì)胞的結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物,其相應(yīng)抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞體系,以及中藥槐耳顆�；蛏剿幪崛∥锫�(lián)合DC-CIK細(xì)胞體系均對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞具有較好殺傷效果,為其臨床應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 .結(jié)腸癌的發(fā)病及其防治
        1.1.1 .結(jié)腸癌的發(fā)病趨勢(shì)
        1.1.2 .結(jié)腸癌的治療現(xiàn)狀
    1.2 .腫瘤干細(xì)胞的概念、特征及分選
        1.2.1 .腫瘤干細(xì)胞的概念
        1.2.2 .腫瘤干細(xì)胞的特征
        1.2.3 .腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定
    1.3 .靶向腫瘤干細(xì)胞的治療策略
        1.3.1 .單克隆抗體的治療
        1.3.2 .靶向腫瘤干細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路、耐藥和凋亡的治療
        1.3.3 .免疫細(xì)胞的治療
    1.4 .中藥在惡性腫瘤治療中的作用
    1.5 .本論文研究目的及意義
第2章 結(jié)腸癌HT29細(xì)胞干細(xì)胞特異性生物標(biāo)志CD133的鑒定
    2.1 .引言
    2.2 .實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.2.1 .實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 .主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.3 .結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)
        2.2.4 .結(jié)腸癌CD133~-細(xì)胞和CD133~+細(xì)胞的分選
        2.2.5 .流式細(xì)胞儀檢測(cè)HT29細(xì)胞中干細(xì)胞(CD133~+細(xì)胞)的比例
        2.2.6 .克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞的克隆形成率
        2.2.7.結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)
        2.2.8 .結(jié)腸癌移植瘤組織HE染色
        2.2.9 .RT-PCR檢測(cè)裸鼠移植瘤中CD133表達(dá)
        2.2.10 .統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.3 .結(jié)果
        2.3.1 .結(jié)腸癌HT29細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.2 .結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.3 .結(jié)腸癌裸鼠移植瘤HE染色結(jié)果
        2.3.4 .RT-PCR檢測(cè)裸鼠移植瘤CD133表達(dá)結(jié)果
    2.4 .討論
        2.4.1 .腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)
        2.4.2 .腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定
    2.5 .本章小結(jié)
第3章 負(fù)載CD133特異性抗原的DC-CIK細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞體外殺傷的研究
    3.1 .引言
    3.2 .實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.2.1 .實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 .主要實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.3 .CD133特異性抗原的制備
        3.2.4 .DC的制備與細(xì)胞免疫表型的檢測(cè)
        3.2.5 .CIK細(xì)胞的制備與細(xì)胞免疫表型的檢測(cè)
        3.2.6 .負(fù)載CD133特異性抗原的DC-CIK細(xì)胞對(duì)HT29細(xì)胞及CD133~+細(xì)胞的體外殺傷實(shí)驗(yàn)
        3.2.7 .統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 .結(jié)果
        3.3.1 .腫瘤干細(xì)胞總RNA和全細(xì)胞裂解物的制備與鑒定
        3.3.2 .AC133原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
        3.3.3 .AC133重組慢病毒感染結(jié)果
        3.3.4 .CIK和DC細(xì)胞的形態(tài)
        3.3.5 .DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞免疫表型分析
        3.3.6 .負(fù)載CD133特異性抗原的DC-CIK細(xì)胞對(duì)HT29細(xì)胞的體外殺傷作用
        3.3.7 .負(fù)載CD133特異性抗原的DC-CIK細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞干細(xì)胞的體外殺傷作用
        3.3.8 .負(fù)載CD133特異性抗原的DC-CIK細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞及其干細(xì)胞殺傷活性的比較
    3.4 .討論
        3.4.1 .腫瘤干細(xì)胞特異性抗原的制備
        3.4.2 .AC133重組慢病毒表達(dá)體系的構(gòu)建
        3.4.3 .腫瘤免疫細(xì)胞治療
    3.5 .本章小結(jié)
第4章 槐耳顆粒及山藥提取物聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞比例的影響
    4.1 .引言
    4.2 .實(shí)驗(yàn)材料與方法
        4.2.1 .實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 .主要實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.3.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
        4.2.4 .流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞干細(xì)胞比例
        4.2.5 .DC-CIK細(xì)胞對(duì)槐耳顆粒與山藥提取物作用HT29細(xì)胞前后殺傷作用的檢測(cè)
        4.2.6 .統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.3 .結(jié)果
        4.3.1 .槐耳顆粒和山藥提取物對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響
        4.3.2 .槐耳顆粒和山藥提取物對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制的影響
        4.3.3 .槐耳顆粒和山藥提取物對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞干細(xì)胞(CD133~+細(xì)胞)表達(dá)的影響
        4.3.4 .DC-CIK細(xì)胞對(duì)槐耳顆粒和山藥提取物作用HT-29細(xì)胞前后殺傷作用的比較
        4.3.5 .DC-CIK細(xì)胞對(duì)槐耳顆粒和山藥提取物作用HT-29細(xì)胞前后CD133~+細(xì)胞比例變化的比較
    4.4 .討論
        4.4.1 .槐耳顆粒在惡性腫瘤中的治療
        4.4.2 .山藥在惡性腫瘤中的治療
    4.5 .本章小結(jié)
第5章 負(fù)載CD133特異性抗原的DC-CIK細(xì)胞、中藥及化療藥聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞的體內(nèi)藥效研究
    5.1 .引言
    5.2 .實(shí)驗(yàn)材料與方法
        5.2.1 .實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.2 .主要實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.3 .建立結(jié)腸癌干細(xì)胞(CD133~+細(xì)胞)裸鼠模型
        5.2.4 .結(jié)腸癌干細(xì)胞荷瘤裸鼠的免疫治療
        5.2.5 .流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血清T淋巴細(xì)胞亞群
        5.2.6 .ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子的含量
        5.2.7 .結(jié)腸癌移植瘤組織HE染色
        5.2.8 .免疫組化檢測(cè)移植瘤組織中Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)
        5.2.9 .用 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化
        5.2.10 .統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    5.3 .結(jié)果
        5.3.1 .結(jié)腸癌裸鼠動(dòng)物模型
        5.3.2 .荷瘤裸鼠生存狀況比較
        5.3.3 .對(duì)荷瘤裸鼠抑瘤的影響
        5.3.4 .荷瘤裸鼠T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果
        5.3.5 .荷瘤裸鼠血清細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果
        5.3.6 .荷瘤裸鼠腫瘤病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果
        5.3.7 .瘤體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Bax表達(dá)結(jié)果
        5.3.8 .信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)水平的結(jié)果
    5.4 .討論
        5.4.1 .結(jié)腸癌治療面臨的挑戰(zhàn)
        5.4.2 .結(jié)腸癌干細(xì)胞荷瘤裸鼠治療的實(shí)驗(yàn)研究
        5.4.3 .荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)作用機(jī)制的研究
    5.5 .本章小結(jié)
第6章 結(jié)論
    6.1 .結(jié)論
    6.2 .創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 .展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄A
    附錄B
    附錄C
發(fā)表論文獲獎(jiǎng)和參加科研情況說明
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2840417