背景急性缺血性卒中因其高的發(fā)病率和致殘率,給家庭和社會帶來沉重的負擔,已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題。有效的治療對于減輕或改善卒中所致的神經功能缺損癥狀,減輕卒中所致的疾病負擔至關重要。中醫(yī)治療卒中有著悠久的歷史,在長期的醫(yī)學實踐中,歷代醫(yī)家總結了豐富的臨床經驗,尤其是王永炎院士提出的“毒損腦絡”學說,將中醫(yī)對中風的認識推向了一個新高度,也推進了中醫(yī)治療中風的進程。根據(jù)“毒損腦絡”學說,提出了清熱解毒通絡法�？嗟幼⑸湟涸谌毖宰渲兄委煼矫姣熜Т_切,可以減輕炎癥反應并改善神經功能和臨床結局,但其作用機制尚未明確。近年的研究顯示,Notch信號通路可能參與了腦梗死炎癥反應過程。因此本研究擬探討苦碟子注射液干預急性腦梗死損傷的機制及與Notch信號通路的相關性。目的觀察苦碟子注射液對腦缺血再灌注損傷火毒證大鼠缺血半暗帶炎癥反應、Notch信號通路、神經元病理結構的改變及神經元凋亡情況的影響,探討苦碟子治療急性腦梗死火毒證的療效機制。方法將128只SPF級SD雄性大鼠,按照隨機數(shù)字表法隨機分為4組:假手術組、模型組、Notch-1抑制組(DAPT組)及苦碟子組,每組32只。除假手術組外,其余各組采用Longa聯(lián)合角叉菜膠腹腔注射制作大鼠左側大腦中動脈阻塞再灌注火毒證模型。再灌注后立即腹腔注射,其中假手術組及模型組給予等體積的生理鹽水(3.6ml/kg·d),各給藥組分別給予對應藥物腹腔注射,其中苦碟子組給予苦碟子注射液3.6ml/kg·d,DAPT組給予DAPT 500ug/kg·d,每天1次,連續(xù)給藥3d。于造模后第3h、24h、48h、72h取材,采集缺血半暗帶腦組織,采用Western blot及RT-PCR法檢測苦碟子注射液治療后Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κ B、Caspase-3在缺血半暗帶腦組織中的表達;用透射電鏡觀察苦碟子注射液干預后缺血半暗帶神經元超微結構的改變;HE染色觀察神經元一般形態(tài)結構改變情況;TUNEL染色觀察缺血半暗帶神經元凋亡情況。結果1.大鼠神經功能缺損評分:組間比較:假手術組神經功能評分為0分。再灌注3h、24h、48h DAPT組和苦碟子組神經功能評分與模型組相比無顯著下降(p0.05),再灌注72h時DAPT組和苦碟子組評分較模型組下降顯著(p0.05);DAPT組與苦碟子組神經功能評分組間比較無統(tǒng)計學差異(p0.05)。組內比較:模型組各時間點神經功能評分比較無統(tǒng)計學差異(p0.05);DAPT組、模型組神經功能于24h后呈逐漸下降趨勢,其中72h神經功能評分較3h顯著下降(p0.05)。2.與假手術組相比,模型組3h即可見Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κ B、caspase-3mRNA和蛋白表達增加(p0.05);且相同時間模型組上述基因和蛋白表達均高于假手術組(p0.05)。模型組Notch-1、IKK、caspase-3蛋白的表達于3h～24h達高峰,隨后呈下降趨勢;NF-κ B蛋白的表達與24h～48h達高峰;Jagged-1、Hes-1蛋白于3h～48h持續(xù)高表達。3.與模型組相比,DAPT治療減少缺血半暗帶Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κB、caspase-3 mRNA和蛋白的水平,部分存在統(tǒng)計學差異;組內比較,DAPT組Notch信號通路蛋白表達趨勢與模型組大致相似。4.與模型組相比,苦碟子注射液可減少缺血半暗帶Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κ B、caspase-3 mRNA和蛋白的表達,部分存在統(tǒng)計學差異�？嗟咏M缺血半暗帶Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κ B、Caspase-3mRNA和蛋白的表達水平低于DAPT組,部分存在統(tǒng)計學差異。組內比較,苦碟子組Notch-1、IKK蛋白的表達于3h～24h達高峰,隨后呈下降趨勢(p0.05);Jagged-1、caspase-3表達于24h達高峰;Hes-1、NF-κ B蛋白的表達于24h～48h達高峰。5.透射電鏡觀察:與假手術組相比,模型組神經元結構出現(xiàn)不同程度損傷,可見核固縮、異染色質增多,線粒體破壞明顯,電子致密;隨著缺血時間的延長,模型組神經元結構改變明顯。同一再灌注時間相比,DAPT組、苦碟子組神經元細胞器結構較模型組改善�？嗟咏M改善情況略微好于DAPT組。6.HE染色:模型組大鼠觀察到梗死側腦組織破壞,結構疏松,神經元數(shù)量減少,多呈三角形,可見胞漿濃縮、胞核固縮。與模型組相比,苦碟子組神經元結構明顯改善;DAPT組神經元結構較模型組改善。7.TUNEL染色結果:模型組TUNEL陽性細胞數(shù)明顯多于假手術組。再灌注48h時,DAPT組、苦碟子組凋亡神經元數(shù)量顯著少于模型組(p0.05),DAPT組與苦碟子組之間差異不顯著(p0.05)。結論1.急性腦梗死后Notch信號通路被激活,缺血腦組織中Notch-1、Jagged-1、Hes-1、IKK、NF-κ B和caspase-3的表達明顯增多。2.苦碟子注射液可通過抑制炎癥反應,減少神經元凋亡減輕腦缺血再灌注損傷,改善火毒證大鼠神經功能�？嗟拥闹委熜Ч麅�(yōu)于DAPT。3.苦碟子注射液減輕腦缺血再灌注損傷可能與調控Notch信號通路有關。4.苦碟子在給藥后3h時即可抑制Notch信號通路活性,且相同時間點Notch信號通路活性低于模型組。因此,臨床上宜盡早予以苦碟子注射液治療急性腦梗死,以改善神經功能。
【學位單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

取正常大鼠腦組織觀察神經元超微結構。正常組神經元結構正常，細胞核大而圓，??染色均勻，表面光滑；胞質中含大量游離核糖體，粗面內質網和線粒體結構正常；血管??壁結構完整，血管內皮細胞、基底膜連接緊密。見圖３－１。??ＢＲ??Ａ：正常組１２０００Ｘ：?Ｂ：正常組７００００Ｘ??圖３－１正常組神經元電鏡結果??３．?２假手術組??假手術各時間組神經元細胞器形態(tài)未見明顯改變，偶見自噬體。見圖３－２。??＿畫??Ａ：假手術組７００００Ｘ；?Ｂ：假手術組７００００Ｘ??圖３－２假手術組神經元電鏡結采??３．３模型組??模型組Ｉｄ組較３ｈ組細胞器結構改變明顯，細胞質明顯水腫，線粒體嵴模糊，部分??嵴和膜融合，可見膜結構不同程度破壞，電子致密，吋見核固縮，０噬體多見。模型組??隨著缺血時間的延長，細胞器結構改變明顯，可見核固縮、胞漿濃縮，胞核異染色質增??多，固縮神經元較多；線粒體腫脹，線粒體嵴枚糊，部分嵴和膜融含，線粒體電子致密??度增高，可見線粒體－自噬體形成，粗面內質Ｍ腫脹、脫顆粒：血管內皮細胞水腫，內??皮細胞間緊密連接斷裂。阽圖３－３。??５１??

取正常大鼠腦組織觀察神經元超微結構。正常組神經元結構正常，細胞核大而圓，??染色均勻，表面光滑；胞質中含大量游離核糖體，粗面內質網和線粒體結構正常；血管??壁結構完整，血管內皮細胞、基底膜連接緊密。見圖３－１。??ＢＲ??Ａ：正常組１２０００Ｘ：?Ｂ：正常組７００００Ｘ??圖３－１正常組神經元電鏡結果??３．?２假手術組??假手術各時間組神經元細胞器形態(tài)未見明顯改變，偶見自噬體。見圖３－２。??＿畫??Ａ：假手術組７００００Ｘ；?Ｂ：假手術組７００００Ｘ??圖３－２假手術組神經元電鏡結采??３．３模型組??模型組Ｉｄ組較３ｈ組細胞器結構改變明顯，細胞質明顯水腫，線粒體嵴模糊，部分??嵴和膜融合，可見膜結構不同程度破壞，電子致密，吋見核固縮，０噬體多見。模型組??隨著缺血時間的延長，細胞器結構改變明顯，可見核固縮、胞漿濃縮，胞核異染色質增??多，固縮神經元較多；線粒體腫脹，線粒體嵴枚糊，部分嵴和膜融含，線粒體電子致密??度增高，可見線粒體－自噬體形成，粗面內質Ｍ腫脹、脫顆粒：血管內皮細胞水腫，內??皮細胞間緊密連接斷裂。阽圖３－３。??５１??

Ａ：模型組?３ｈ?１２００００Ｘ；?Ｂ：模型組?２４ｈ?１５００００Ｘ；?Ｃ：模型組?４８ｈ?７００００Ｘ；??Ｄ：模?７２ｈ?１００００Ｘ??圖３－３模型組神經元電鏡結果??３．４?ＤＡＰＴ?組??ＤＡＰＴ組各時間組與模型組相比，神經元形態(tài)稍好，細胞核染色比較均勻，異染色質??較少，部分線粒體腫脹、嵴模糊，部分粗面內質網腫脹、脫顆粒，線粒體、粗面內質網??結構改變較模型組輕。見圖３－４。??瞧??＿＿??Ａ：?ＤＡＰＴ?組?３ｈ?１２００００Ｘ；?Ｂ：?ＤＡＰＴ?組?２４ｈ?５００００Ｘ；?Ｃ：?ＤＡＰＴ?組?４８ｈ?７００００Ｘ??Ｄ：?ＤＡＰＴ?組?７２ｈ?１２００００Ｘ??圖３－４?ＤＡＰＴ組神經元電鏡結果??５２??
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本文編號：2837613