發(fā)布時(shí)間：2020-10-09 01:53

　　 目的探究烏頭湯延緩膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨退變的抗炎作用機(jī)制,為烏頭湯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。方法1.從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度,分析烏頭湯發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。2.復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型后,隨機(jī)分為正常組、模型組、烏頭湯組與對照組(雙氯芬酸鈉),進(jìn)行干預(yù)后置于麻醉下取材,后經(jīng)HE染色、透射電鏡鏡下觀察軟骨組織的形態(tài)學(xué)與軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;Western Blot法檢測P38 MAPK、JNK、Ras、ERK、i NOS蛋白含量表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測滑膜組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α含量表達(dá)。3.軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立,甲苯胺藍(lán)染色與Ⅱ型膠原染色進(jìn)行軟骨細(xì)胞的鑒定;使用倒置顯微鏡鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài);MTT法檢測烏頭湯對LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞活性影響;酶聯(lián)免疫吸附測定法分別檢測軟骨細(xì)胞上清液中NO、SOD的含量表達(dá);RT-PCR、Western Blot分別檢測各組軟骨細(xì)胞與炎癥信號通路相關(guān)的P38 MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、ERK、i NOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、IκB基因與蛋白的含量表達(dá)。結(jié)果1.烏頭湯中的主要有效成分涵蓋生物堿類、黃酮類、皂苷類等化合物,可從p38MAPK、JNK、i NOS等信號途徑發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用,為深入研究其防治KOA的分子機(jī)制提供思路。2.HE染色結(jié)果顯示,烏頭湯組、對照組(雙氯芬酸鈉)淺表層切線與關(guān)節(jié)面基本平行且完整,移行層、輻射層、鈣化層及其他層次結(jié)構(gòu)相對清晰可辨;透射電鏡觀察顯示,烏頭湯組、對照組(雙氯芬酸鈉)的軟骨細(xì)胞外形變化較小,呈類圓形,外層微絨毛附著,細(xì)胞核較大,異染色質(zhì)、糖原顆粒與橢圓狀的線粒體散在分布,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)較為完整清晰;Western Blot結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組的P38 MAPK、JNK、Ras、ERK、i NOS蛋白含量均表達(dá)升高(P0.01),與模型組比較,對照組、烏頭湯組的P38 MAPK、JNK、Ras、ERK、i NOS蛋白含量均表達(dá)降低(P0.05或P0.01);ELISA結(jié)果顯示,烏頭湯、對照組的滑膜組織中IL-1β、TNF-α含量表達(dá)均低于模型組(P0.01)。3.第2代軟骨細(xì)胞形態(tài)一致、胞核可視且清晰,生長狀態(tài)良好;經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后,軟骨細(xì)胞胞內(nèi)及其周圍區(qū)域可見紫紅色異染顆粒;經(jīng)Ⅱ型膠原染色后,陽性對照組胞漿區(qū)呈棕黃色;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,烏頭湯水提物對LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的最佳干預(yù)時(shí)間和濃度分別為24 h和150μg/m L;ELISA結(jié)果顯示,與模型組比,烏頭湯水提物組的NO含量表達(dá)低于模型組(P0.01),而SOD含量明顯高于模型組,尤其以150μg/m L組變化顯著(P0.01);RT-PCR、Western Blot法檢測結(jié)果顯示,烏頭湯水提物各濃度組(100、150、200μg/m L)對LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞干預(yù)24 h后,均可改善與炎癥信號通路相關(guān)的P38 MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、ERK、i NOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、IκB基因與蛋白含量表達(dá),尤其以烏頭湯水提物150μg/m L變化顯著(P0.01)。結(jié)論1.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明烏頭湯可通過多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。2.烏頭湯可改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)結(jié)構(gòu),并下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨、滑膜組織中與炎癥相關(guān)調(diào)節(jié)因子含量表達(dá),延緩膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨退變。3.烏頭湯通過降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中與炎癥相關(guān)調(diào)節(jié)因子含量表達(dá),發(fā)揮抗炎作用。
【學(xué)位單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
引言
第一部分 烏頭湯發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究
    1 研究目的
    2 材料
        2.1 試驗(yàn)藥物
        2.2 研究工具
    3 試驗(yàn)方法
        3.1 烏頭湯的配體分子集建立
        3.2 烏頭湯的化學(xué)空間構(gòu)建
        3.3 烏頭湯中發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
    4 結(jié)果
        4.1 烏頭湯的化學(xué)空間特征
        4.2 烏頭湯中發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)
    5 討論
        5.1 中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究
        5.2 烏頭湯藥效成分研究
        5.3 烏頭湯的藥理作用研究
        5.4 從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究烏頭湯發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的機(jī)理
    6 小結(jié)
第二部分 烏頭湯延緩膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨退變的抗炎機(jī)制研究
    1 研究目的
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)動物
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 藥物制備
        3.2 動物分組、造模、干預(yù)、取材
        3.3 一般情況觀察
        3.4 滑膜組織觀察
        3.5 軟骨組織HE染色
        3.6 透射電鏡觀察軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化
        3.7 Western Blot檢測關(guān)節(jié)軟骨中p38MAPK、JNK、Ras、p-ERK1/2、iNOS蛋白含量表達(dá)
        3.8 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、TNF-α含量表達(dá)
    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.1 一般情況觀察
        5.2 滑膜組織觀察結(jié)果
        5.3 軟骨組織HE染色結(jié)果
        5.4 透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果
        5.5 Western Blot結(jié)果
        5.6 ELISA檢測結(jié)果
    6 討論
    7 小結(jié)
第三部分 烏頭湯對LPS誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響
    1 研究目的
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)動物
        2.2 主要試劑
        2.3 主要儀器
        2.4 主要實(shí)驗(yàn)用液配制
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 烏頭湯水提物的制備
        3.2 軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
        3.3 LPS誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞致炎模型的復(fù)制
        3.4 MTT比色試驗(yàn)檢測軟骨細(xì)胞活性
        3.5 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測各組軟骨細(xì)胞上清液NO、SOD含量表達(dá)
        3.6 RT-PCR法檢測軟骨細(xì)胞中p38MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、ERK、iNOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、IκB mRNA含量表達(dá)
        3.7 Western Blot法檢測軟骨細(xì)胞中p38MAPK、C-myc、C-fos、C-jun、Ras、p-ERK1/2、iNOS、TNF-a、NF-κB p65、IKK、p-IκB蛋白含量表達(dá)
    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.1 軟骨細(xì)胞鏡下觀察
        5.2 甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組化鑒定結(jié)果
        5.3 MTT檢測結(jié)果
        5.4 ELISA檢測結(jié)果
        5.5 RT-PCR檢測結(jié)果
        5.6 Western Blot檢測結(jié)果
    6 討論
    7 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷

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本文編號：2833061