月華丸（膠囊）對耐多藥結(jié)核菌感染自噬關鍵蛋白LC3、Beclin-1的影響

發(fā)布時間：2020-10-08 21:16

　　目的觀察和探討月華丸(膠囊)對耐多藥結(jié)核菌感染單核巨噬細胞自噬關鍵蛋白LC3、Beclin-1的影響,從血清藥理學及分子生物學角度,揭示其對耐多藥結(jié)核菌感染巨噬細胞自噬的作用及其機制,為明確傳統(tǒng)名方月華丸抗結(jié)核的效應提供實驗依據(jù)。方法(1)月華丸(膠囊)含藥血清的制備。以人與大鼠間按體表面積換算等效劑量,取3.02mg·kg-1的劑量,給大鼠每日灌胃1次,連續(xù)灌胃7天,經(jīng)腹主動脈取血制備含藥血清。(2)含藥血清有效濃度測定。CCK-8法檢測月華丸(膠囊)含藥血清對小鼠單核巨噬細胞活性的影響,選取月華丸(膠囊)含藥血清有效作用濃度。(3)按細胞:細菌=1:10構建細胞感染模型。(4)自噬關鍵蛋白LC3B、Beclin-1及其基因測定,以月華丸(膠囊)含藥血清干預感染結(jié)核分枝桿菌的小鼠單核巨噬細胞,實驗共分為5組:(1)陰性對照組;(2)10%月華丸(膠囊)含藥血清組;(3)自噬抑制劑組:自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)+月華丸(膠囊)含藥血清組;(4)自噬誘導劑組:雷帕霉素(Rep)組;(5)正常組:未被感染的細胞組。培養(yǎng)8小時后,采用間接免疫熒光法、Western blot、實時熒光定量RT-q PCR法檢測LC3B蛋白、Beclin-1蛋白及其基因表達情況。結(jié)果(1)CCK-8檢測月華丸(膠囊)含藥血清對小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)活力作用表明,10%含藥血清濃度時細胞增殖效果佳,與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)(1)間接免疫熒光測驗顯示:陰性對照組細胞胞漿中未見LC3B蛋白顆粒。與陰性對照組比較:10%月華丸(膠囊)含藥血清組細胞胞漿LC3B蛋白顆粒明顯增多;自噬誘導劑組細胞胞漿LC3B蛋白顆粒最多;自噬抑制劑組細胞胞漿中未見明顯增多的LC3B蛋白顆粒。(2)Western blot顯示:與陰性對照組、正常組、自噬抑制劑組比較,10%月華膠囊含藥血清組、自噬誘導劑組細胞的Beclin-1、Beclin-1/β-actin比值均明顯增加,Beclin-1蛋白表達增高,其差異的顯著性有統(tǒng)計學意義(P0.05);陰性對照組、正常組、自噬抑制劑組細胞間各比值差異的顯著性無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)RT-q PCR顯示:與正常組、陰性對照組、自噬抑制劑組含藥血清組比較,10%月華丸含藥血清組、自噬誘導劑組細胞中LC3、Beclin-1m RNA相對于內(nèi)參基因的表達量值明顯增加,LC3、Beclin-1m RNA表達均增高,其差異的顯著性有統(tǒng)計學意義(p0.05);正常組、陰性對照組、自噬抑制劑組間各值比較,差異的顯著性無統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論(1)月華丸(膠囊)含藥血清能促進小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)的增殖,對其活力有促進作用。(2)10%月華丸(膠囊)含藥血清調(diào)控Beclin-1、LC3 m RNA及蛋白表達增高。證明月華丸(膠囊)能誘導被耐多藥結(jié)核菌感染巨噬細胞自噬。檢測耐多藥結(jié)核菌感染上述蛋白表達變化有助于為耐多藥結(jié)核提供新的治療方法。
【學位單位】：湖南中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

抗酸染色,結(jié)核分枝桿菌,形態(tài),細菌

菌的培養(yǎng) 菌株接種于補充有 10％OADC（油酸，白蛋白，葡％Tween-的 Middlebrook 7H9 肉湯中，37℃搖床培 PBS-0.05％Tween-80 中 4℃，5000 r·min-1 洗滌兩培養(yǎng)基中。運用細菌麥氏比濁儀計算、調(diào)整細菌濃lebrook 7H9 液體培養(yǎng)基，配置 1×106CFU/m 菌懸液。