發(fā)布時間：2020-09-30 20:01

　　 研究背景及目的:氧化應(yīng)激損傷是心血管疾病的一個重要的致病因素。缺血缺氧導(dǎo)致心肌細胞產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)。而活性氧在控制血管內(nèi)皮功能、血管張力以及誘導(dǎo)心肌細胞肥大、增殖、凋亡、遷移等病理生理過程中有著重要作用。鼠李素是具有較高的生物活性的黃酮類化合物之一,其對心肌氧化應(yīng)激損傷具有保護作用,但是關(guān)于其發(fā)揮作用的分子生物學(xué)機制的研究較少,因此本研究的主要目的是采用RNA-Seq分析技術(shù)和多種生物信息學(xué)方法來揭示鼠李素保護心肌氧化應(yīng)激損傷的分子機制,為臨床治療提供新的作用靶點。方法:通過H_2O_2誘導(dǎo)大鼠心肌細胞H9C2,建立損傷模型。H_2O_2處理H9C2細胞作為對照組,H_2O_2處理+鼠李素給藥為處理組,提取RNA并進行轉(zhuǎn)錄組測序,并根據(jù)測序結(jié)果進行以下分析:(1)篩選差異表達基因與構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)。采用NOISeq數(shù)據(jù)分析包計算差異表達基因,設(shè)置篩選條件為:P value0.05及|log2FC|2�；贕ene ontology數(shù)據(jù)庫以及KEGG通路數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行功能以及通路富集分析�；赟tring數(shù)據(jù)庫信息,建立蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò),設(shè)置條件:combined score不低于0.9�；贑ytosape插件MCODE進行子網(wǎng)絡(luò)模塊挖掘,閾值設(shè)置:Degree Cut off=2,Node Score Cutoff=0.2,K-Core=2,Max.Depth=100。(2)差異表達基因數(shù)據(jù)的深度挖掘�；趍iRWalk2.0工具檢索差異表達基因的調(diào)控miRNA,并利用R軟件包clusterprofiler對miRNA進行KEGG功能富集分析�；趍iRBase,miranda工具篩選score180的miRNA-lncRNA關(guān)系對。ceRNA以及miRNA-TF-gene網(wǎng)絡(luò)中差異基因的GO-BP功能和KEGG富集運用DAVID工具來分析。運用WebGestalt網(wǎng)站對差異表達基因轉(zhuǎn)錄因子進行預(yù)測�；贒GIdb藥物預(yù)測受miRNA和TF調(diào)控的關(guān)鍵差異基因的Drug-gene互作關(guān)系對�；谲浖﨏ytoscape構(gòu)建miRNA-gene,miRNA-lncRNA,ceRNA,TF-gene,miRNA-TF-gene以及Drug-gene互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。(3)差異表達基因的qPCR驗證�；谏镄畔W(xué)預(yù)測出的差異表達基因,篩選上調(diào)表達基因(NOTCH3,NUMBL,BCL2L11)和下調(diào)表達基因(PPP6C,MAPK1),通過qPCR方法檢測其在大鼠心肌細胞H9C2對照組(H_2O_2處理)和實驗組(H_2O_2處理+鼠李素給藥)中的表達差異情況。結(jié)果:(1)通過比較對照組(H_2O_2處理)和實驗組(H_2O_2處理+鼠李素給藥)的表達數(shù)據(jù),共獲得1452個差異表達基因,其中對應(yīng)上調(diào)和下調(diào)基因分別為703個和749個。GO功能富集分析結(jié)果顯示,差異表達基因涉及的生物進程主要包括細胞或大分子代謝、細胞周期或細胞分裂、代謝或信號通路的調(diào)控、信號通路等。KEGG通路富集分析主要涉及的關(guān)鍵信號通路包括細胞粘著連接,Notch信號通路、氧化磷酸化、蛋白水解等。PPI網(wǎng)絡(luò)共包括609個節(jié)點,并得到了2個score6的子網(wǎng)絡(luò)模塊,其中模塊1涵蓋了17個節(jié)點,并富集在mRNA降解、翻譯、蛋白質(zhì)定位相關(guān)的功能上;而模塊2涵蓋15個節(jié)點,主要富集于細胞分裂過程相關(guān)功能上。(2)通過對差異表達基因做聚類熱圖分析顯示,實驗組和對照組之間差異明顯。差異表達基因調(diào)控miRNA的預(yù)測共獲得189個miRNA以及577對miRNA-gene調(diào)控關(guān)系對。其中較為關(guān)鍵的miRNA主要包括miRNA-349,miR-211-5p以及miR-17-5p等。KEGG通路富集顯示預(yù)測得到的miRNA顯著富集到75個通路中,其中AMPK及PI3K-Akt信號通路富集的miRNA最多。通過對miRNA-gene調(diào)控關(guān)系作圖,共獲得120個節(jié)點和216個互作關(guān)系對�；谝延械膍iRNA對其調(diào)控的lncRNA進行預(yù)測共獲得475個miRNA-lncRNA關(guān)系對。ceRNA網(wǎng)絡(luò)中共有74個miRNA,90個mRNA以及60個lncRNA,其GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,主要涉及的生物學(xué)過程包括RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(GO:0045944),凋亡負調(diào)節(jié)過程(GO:0043066)以及轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(GO:004589)等過程;主要涉及的關(guān)鍵信號通路包括腎上腺素以及Notch等信號通路。此外,對差異表達基因相關(guān)的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子進行預(yù)測,共獲得9個轉(zhuǎn)錄因子(PAX4,ELK1,ETS2,NRF1,GABP,E4F1,CACBINDINGPROTEIN,AP2ALPHA以及AP2GAMMA)。進一步地,通過構(gòu)建miRNA-TF-gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò)整合得到241個調(diào)控關(guān)系對,且功能富集和通路富集分別富集到145個GO-BP結(jié)果和52個KEGG通路,富集結(jié)果與ceRNA網(wǎng)絡(luò)基本一致。最后,我們對drug-gene互作關(guān)系進行預(yù)測并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),結(jié)合富集生物學(xué)過程分析的與藥物反應(yīng)相關(guān)的基因分析發(fā)現(xiàn)基因BCL2L1,DNMT3A,HDAC2,STAT3等基因為重要的藥物小分子基因。(3)qPCR結(jié)果顯示,與對照組相比鼠李素處理組中的NOTCH3、MAPK1基因表達水平顯著性下調(diào)(P0.05),BCL2L11基因表達顯著性上調(diào)(P0.05),而上調(diào)基因BCL2L11與下調(diào)基因MAPK1表達趨勢與前期預(yù)測結(jié)果相符,但差異不顯著(P0.05)。結(jié)論:總的來說,本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對鼠李素對心肌氧化應(yīng)激損傷保護作用的分子機制進行了研究。通過對心肌細胞鼠李素處理組以及對照組分析獲得關(guān)鍵差異表達基因包括COX6A2,NDUFA2,UBA52,CDK1,MAPK1,Klf9以及NAA15;重要的miRNA包括miR-211-5p以及miR-17-5p;重要的轉(zhuǎn)錄因子包括ELK1及PAX4等;重要的信號通路包括Notch,AMPK以及PI3K/Akt信號通路;重要的藥物小分子基因包括BCL2L1,DNMT3A,HDAC2以及STAT3。同時,該研究構(gòu)建了一系列調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,系統(tǒng)闡述了鼠李素對心肌氧化應(yīng)激損傷保護作用過程中不同作用因子之間的相互作用關(guān)系,這也將為今后的研究提供重要的依據(jù)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

轉(zhuǎn)錄組測序的流程圖

第 2 章 使用 RNA-seq 數(shù)據(jù)分析鼠李素在心肌氧化應(yīng)激損傷中的保護作用及機制果NA 質(zhì)量控制瓊脂糖凝膠電泳組和對照組的細胞進行總 RNA 提取，后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見 18S、28S 條帶清晰，且亮度比為 28S: 18S，約為 2: 1。這說明 濃度較高，無明顯的降解，可用于構(gòu)建 cDNA 文庫進行 RNAseq 分

測序結(jié)果堿基組成情況

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