發(fā)布時間：2020-09-30 19:19

　　 目的:考察丹參注射液對體外培養(yǎng)的原代人軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的生物效應(yīng),探討其治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理。方法:以丹參注射液丹參生藥(1.5 mg· mL-1)作為計算藥物濃度。軟骨細(xì)胞藥物分組:對照組、0.5、1.0、2.0、4.0 mg· mL-1。成骨細(xì)胞藥物分組:對照組、0.5、1.0、2.0、3.0 mg ·mL-1。用指示細(xì)胞培養(yǎng)法(DNA染色法)檢測人原代軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是否有支原體污染;用RT-PCR法檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原基因的表達(dá)鑒定軟骨細(xì)胞;用ALP活性檢測和茜素紅染色法染色鈣結(jié)節(jié)鑒定成骨細(xì)胞;用MTT(Methylthiazole tetrazolium)法評價原代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(第3代)和成骨細(xì)胞hFOB1.19增殖活性;用熒光定量RT-PCR法測定軟骨細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原基因的表達(dá)量,成骨細(xì)胞BMP-2、Runx2、OCN、COL1A1、BSP基因的表達(dá)量;用酶聯(lián)免疫方法檢測軟骨細(xì)胞I、II型膠原的含量,成骨細(xì)胞I型膠原、OPN、OCN含量;用糖胺多糖試劑盒法檢測軟骨細(xì)胞總糖胺多糖的含量,評價軟骨細(xì)胞的功能蛋白水平;用堿性磷酸酶試劑盒法檢測成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性。結(jié)果:1、支原體檢測和細(xì)胞鑒定:結(jié)果顯示,支原體陽性對照和陰性對照試驗(yàn)結(jié)果有效,人原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞無支原體檢出;細(xì)胞檢測出Ⅰ、Ⅱ型膠原基因的表達(dá),說明細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞檢測到ALP以及出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié),說明細(xì)胞hFOB1.19具有成骨能力。2、軟骨細(xì)胞生物效應(yīng)研究:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各濃度丹參注射液組的細(xì)胞相對活性均低于對照組,且降低趨勢有量-效關(guān)系,提示丹參注射液對原代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有生長抑制效應(yīng);熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示,各濃度組細(xì)胞I型膠原mRNA表達(dá)量均低于對照組,且有一定的量-效關(guān)系;I型膠原蛋白檢測結(jié)果顯示,低劑量(≤2.0 mg ·mL-1)組可顯著抑制I型膠原表達(dá)。這些結(jié)果提示低劑量的丹參注射液可能對原代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的脫分化有一定的抑制作用。同時,低劑量丹參注射液(≤4.0 mg ·mL-1)能促進(jìn)糖胺多糖的含量增加,提示低劑量丹參注射液有促進(jìn)軟骨形成的生物效應(yīng)。3、成骨細(xì)胞生物效應(yīng)研究:MTT結(jié)果顯示,4.0、6.0、8.0、10.0 mg· mL-1濃度的丹參注射液的成骨細(xì)胞相對活性均低于對照組,且降低趨勢有量-效關(guān)系。低劑量(4.0 mg·mL-1 組對成骨細(xì)胞增殖無影響;熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示,給藥3 天時,2.0mg·mL-1 組上調(diào)了 BMP-2、Runx2、OCN、COL1A1、BSPmRNA 的表達(dá)。給藥7天時,對各基因表達(dá)與對照組相比沒有顯著性差異;堿性磷酸酶結(jié)果顯示,作用3天時,各濃度組均可促進(jìn)堿性磷酸酶活性,作用7天時,對堿性磷酸酶活性與對照組相比沒有顯著性差異;ELISA檢測結(jié)果顯示,作用3天時,2.0 mg ·mL-1組可促進(jìn)[型膠原蛋白含量,2.0、3.0 mg· mL-1組可促進(jìn)OCN含量,0.5、1.0、2.0 mg·mL-1組OPN含量與對照組相比無顯著性差異。結(jié)論:1、人原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞hFOB1.19沒有支原體污染。細(xì)胞分別鑒定為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。2、低劑量的丹參注射液可輕微抑制人第3代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖,抑制I型膠原(脫分化指標(biāo))的形成和促進(jìn)糖胺多糖的合成,提示其具有促進(jìn)軟骨形成的生物效應(yīng)。3、在不影響成骨細(xì)胞增殖的情況下,一定濃度丹參注射液可促進(jìn)BMP-2、Runx2、OCN、COL1A1、BSPmRNA的表達(dá),及堿性磷酸酶活性、I型膠原蛋白、OCN含量。提示其具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)成骨效應(yīng)。
【學(xué)位單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
英文縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
第一章 細(xì)胞質(zhì)量評價
    第一節(jié) 細(xì)胞支原體檢測
        1 材料與儀器
            1.1 試劑和材料
            1.2 儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 樣品及試劑的制備
            2.2 指示細(xì)胞的制備
            2.3 接種
            2.4 染色及檢測
        3 結(jié)果
        4 結(jié)論
    第二節(jié) 軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞鑒定
        1 材料與儀器
            1.1 材料與試劑
            1.2 儀器
        2 方法
            2.1 原代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)
            2.2 RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原基因
            2.3 人成骨細(xì)胞培養(yǎng)
            2.4 成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)染色
            2.5 成骨細(xì)胞堿性磷酸酶檢測
        3 結(jié)果
            3.1 軟骨細(xì)胞形態(tài)
            3.2 軟骨細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原mRNA檢測
            3.3 鈣結(jié)節(jié)染色
            3.4 ALP檢測
        4 結(jié)論
第二章 丹參注射液體外對原代人軟骨細(xì)胞的生物效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究
    1 材料與儀器
        1.1 材料
        1.2 儀器
    2 方法
        2.1 MTT實(shí)驗(yàn)
        2.2 熒光定量RT-PCR
        2.3 ELISA方法檢測Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量
        2.4 糖胺多糖的檢測
        2.5 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 對軟骨細(xì)胞增殖的影響
        3.2 mRNA表達(dá)水平
        3.3 丹參注射液對Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量的影響
        3.4 丹參注射液對糖胺多糖含量的影響
    4 討論
第三章 丹參注射液體外對人成骨細(xì)胞的生物效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究
    1 材料與儀器
        1.1 試劑
        1.2 儀器
    2 方法
        2.1 MTT實(shí)驗(yàn)
        2.2 堿性磷酸酶檢測
        2.3 qRT-PCR檢測細(xì)胞各指標(biāo)mRNA
        2.4 ELISA方法檢測各指標(biāo)的含量
        2.5 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 不同濃度SMI對成骨細(xì)胞增殖影響
        3.2 實(shí)驗(yàn)成骨細(xì)胞ALP含量
        3.3 qRT-PCR檢測各指標(biāo)的熔解曲線
        3.4 qRT-PCR檢測各指標(biāo)的擴(kuò)增曲線
        3.5 qRT-PCR檢測各指標(biāo)mRNA表達(dá)量
        3.6 ELISA法檢測Ⅰ型膠原、OPN、OCN含量
    4 討論和結(jié)論
第四章 全文總結(jié)和展望
    1 總結(jié)
    2 展望
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷

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7 張e

本文編號：2831265