研究目的:多柔比星是治療乳腺癌一線化療藥物之一,但大多數(shù)患者在多柔比星使用過程中易發(fā)生獲得性耐藥現(xiàn)象,從而降低療效。目前的研究表明,藥物轉(zhuǎn)運體表達與功能的變化與腫瘤細胞獲得性耐藥密切相關(guān)。姜黃素近年來被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤的作用,可通過調(diào)控藥物轉(zhuǎn)運體增加多種化療藥物的敏感性。本研究擬觀察ABC轉(zhuǎn)運體超家族MDR1和MDR3在乳腺癌多柔比星獲得性耐藥中的作用,并探討姜黃素對這些轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的獲得性耐藥現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)作用及其分子機制。研究方法:1.采用實時熒光定量PCR法(Real-time PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法在乳腺癌多柔比星敏感性MCF-7細胞和多柔比星耐藥性MCF-7/DOX細胞中篩選與多柔比星獲得性耐藥密切相關(guān)的藥物轉(zhuǎn)運體。2.MDCKⅡ單層細胞雙向轉(zhuǎn)運功能實驗觀察藥物轉(zhuǎn)運體MDR1和MDR3對多柔比星的轉(zhuǎn)運功能;CCK-8法檢測MDR1和MDR3對MCF-7和MCF-7/DOX細胞對多柔比星敏感性的影響;流式細胞術(shù)檢測兩種藥物轉(zhuǎn)運體對細胞內(nèi)多柔比星累積的影響。3.亞硫酸氫鹽測序法(bisulfitesequencingpcr,bsp)和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitation,chip)觀察dna甲基化和組蛋白乙�；揎棇dr1和mdr3表達的影響。4.cck-8法和流式細胞術(shù)檢測姜黃素對mcf-7和mcf-7/dox細胞多柔比星敏感性及胞內(nèi)蓄積濃度的影響。5.實時熒光定量pcr法和蛋白質(zhì)免疫印跡法觀察姜黃素對mcf-7和mcf-7/dox細胞中mdr1和mdr3表達的影響;bsp和chip法觀察姜黃素對mdr1和mdr3基因dna甲基化與組蛋白乙�；揎椀挠绊�。6.mdckⅡ單層細胞雙向轉(zhuǎn)運實驗觀察姜黃素對mdr1和mdr3轉(zhuǎn)運多柔比星功能的影響;atp酶活性實驗觀察姜黃素對mdr1和mdr3功能影響的機制。研究結(jié)果:1.與多柔比星敏感性mcf-7細胞相比,多柔比星耐藥性mcf-7/dox細胞中藥物轉(zhuǎn)運體mdr1和mdr3在mrna水平的表達明顯增加(4299.64±326.96)倍與(350.651±42.18)倍(p0.05),蛋白水平分別上調(diào)了(4.83±0.37)與(2.46±0.23)(p0.05)。2.mdr1和mdr3均對多柔比星具有轉(zhuǎn)運功能,其轉(zhuǎn)運動力學(xué)參數(shù)km值分別為(18.74±6.35)和(63.12±20.13)μm;vmax值分別為(400.78±120.45)和(194.18±89.62)nmol·min-1·mg-1。3.mdr1和mdr3蛋白表達水平與乳腺癌細胞多柔比星敏感性及多柔比星濃度呈反比。4.mdr1和mdr3在mcf-7/dox細胞中的表達上調(diào)與其基因啟動子區(qū)dna低甲基化與組蛋白高乙酰化水平密切相關(guān)。5.姜黃素可以呈濃度、時間依賴性地顯著增加mcf-7與mcf-7/dox細胞的多柔比星敏感性及胞內(nèi)多柔比星蓄積濃度。6.姜黃素對mcf-7及mcf-7/dox細胞中mdr1和mdr3的表達水平有上調(diào)作用,該作用與降低mdr1和mdr3基因啟動子區(qū)甲基化水平、升高組蛋白乙酰化水平密切相關(guān)。7.姜黃素對mdr1和mdr3介導(dǎo)的多柔比星外排功能有顯著抑制作用,該作用與抑制兩種轉(zhuǎn)運體的atp酶活性密切相關(guān)。研究結(jié)論:abc家族藥物轉(zhuǎn)運體mdr1和mdr3對多柔比星均具有轉(zhuǎn)運功能,并且其表達水平在乳腺癌mcf-7細胞多柔比星獲得性耐藥產(chǎn)生過程中明顯升高;降低mdr1與mdr3的表達水平可以下調(diào)mcf-7和mcf-7/dox細胞內(nèi)多柔比星的蓄積濃度,增加其藥物敏感性;mdr1和mdr3表達上調(diào)與其基因啟動子區(qū)甲基化和組蛋白乙酰化水平密切相關(guān)。姜黃素可顯著增加乳腺癌細胞多柔比星敏感性及胞內(nèi)蓄積濃度,主要與其抑制mdr1與mdr3的atp酶活性從而影響多柔比星的外排有關(guān)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1.1 多柔比星耐藥過程中 MDR1 和 MDR3 mRNA 水平變化Figure 1.1 Fold Changes of MDR1 and MDR3 mRNA levels after doxorubicin acquiredresistance注：n=3, *: P<0.05, 與對照組相比較。

圖 1.2 多柔比星耐藥過程中 MDR1 和 MDR3 蛋白水平變化 1.2 Fold Changes of MDR1 and MDR3 protein levels during the drug resisdoxorubicin注：n=3, *: P<0.05, 與對照組相比較。

MDR3 對多柔比星具有轉(zhuǎn)運功能究了 MDR1 和 MDR3 對多柔比星的轉(zhuǎn)運功能及其動力分別轉(zhuǎn)染 MDR1 和 MDR3 基因的表達質(zhì)粒構(gòu)建過表1 和 MDCKⅡ-MDR3。如圖所示，MDR1 和 MDR3 在 在 mRNA 水平分別上調(diào)（320.5±29.45）、（246.54±18.3，在蛋白質(zhì)水平分別上調(diào)（2.45±0.29）、（2.04±0.18）倍明過表達模型構(gòu)建成功，可進行下游功能實驗。隨后用實驗觀察 MDR1 與 MDR3 對多柔比星的轉(zhuǎn)運功能。3 對多柔比星均具有轉(zhuǎn)運功能，且兩者對多柔比星轉(zhuǎn)運其相應(yīng)的轉(zhuǎn)運速率分別為（400.78±120.45）和（1941，親和力分別為（18.74±6.35）和（63.12±20.13）μM（

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本文編號：2830925