目的:從中國藥用植物苦楝中提取的一類檸檬苦素類化合物及結(jié)構(gòu)與之相似的洋椿苦素,檢測其在體外對紅白血病細(xì)胞的抑制作用,及在體內(nèi)對紅白血病小鼠的治療作用,并開展其具體作用機(jī)制的研究。方法:體外實(shí)驗(yàn):1.篩選化合物:在藥物庫中通過MTT的方法篩選出一類具有抗白血病活性的化合物。2.測定細(xì)胞生長曲線:將HEL(人紅白血病細(xì)胞)和CB7(小鼠紅白血病細(xì)胞)按每孔約10~4個(gè)鋪板于96孔板內(nèi),化合物分別作用0、24、48、72小時(shí)后加MTT培養(yǎng)4小時(shí),然后用酶標(biāo)儀檢測吸光度值,并繪制細(xì)胞生長曲線。3.檢測細(xì)胞凋亡:細(xì)胞鋪板加化合物培養(yǎng)24小時(shí)后,置于流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞凋亡的情況。4.細(xì)胞周期和周期蛋白的表達(dá):通過流式細(xì)胞儀檢測周期阻滯、利用Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證周期蛋白的變化。5.細(xì)胞分化及分化相關(guān)基因的變化:用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分化的方向,并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。6.分子對接和MAPK/ERK通路:用電腦Autodock分析化合物和蛋白的結(jié)合位點(diǎn),尋找化合物作用于紅白血病的可能性靶點(diǎn),用Western Blot檢測MAPK/ERK通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):1.動物模型的建立及分組:腹腔注射出生48小時(shí)內(nèi)的Balb/c小鼠Friend病毒,建立紅白血病小鼠動物模型,4-5周后將雌鼠和雄鼠分開,并隨機(jī)進(jìn)行分組,分為DMSO對照組和實(shí)驗(yàn)組。2.藥物治療:分組完成1周后給小鼠隔一天腹腔注射一次藥物(3mg/kg),總共注射6次。3.取材及繪制生存曲線:給藥完成后2周左右,一部分小鼠用于取脾臟、心臟血液及骨髓,記錄數(shù)值,骨髓用于檢測造血干細(xì)胞的變化比例;其他小鼠繼續(xù)觀察,待小鼠死亡后記錄死亡時(shí)間,繪制生存曲線。結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn):1.篩選出3個(gè)檸檬苦素類化合物,分別為:12-hydroxyamoorastin、1-deacetylsendanin和29-iso-butylsendanin(編號:A1541、A1542、A1543)。2.細(xì)胞生長曲線顯示A1541、A1542、A1543和洋椿苦素可以明顯抑制紅白血病細(xì)胞的生長。3.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示化合物可以引起細(xì)胞凋亡。4.化合物可以導(dǎo)致周期阻滯,A1541、A1542、A1543導(dǎo)致G2期阻滯,但洋椿苦素是S期阻滯;但都可以使CDK2表達(dá)下調(diào)。5.這4種化合物根據(jù)細(xì)胞的不同引起不同的分化方向,A1541、A1543使HEL細(xì)胞發(fā)生巨核分化和紅系分化,A1541、A1543和洋椿苦素促使CB7細(xì)胞只發(fā)生紅系分化;與在基因表達(dá)層面的結(jié)果一致。6.分子對接結(jié)果顯示這4種化合物作用于紅白血病的可能靶點(diǎn)是ERK;在MAPK/ERK通路中,A1541、A1542、A1543使P-ERK和P-MEK都上調(diào)而洋椿苦素使之下調(diào)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):1.與DMSO組相對比,實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存時(shí)間明顯延長。2.小鼠的脾臟大小變化不明顯。3.實(shí)驗(yàn)組小鼠的血細(xì)胞比容(Hct)升高。4.骨髓中造血干細(xì)胞比例增加。結(jié)論:檸檬苦素類化合物可抑制紅白血病細(xì)胞生長,通過MAPK/ERK通路可能的靶點(diǎn)為ERK1/2,使HEL和CB7細(xì)胞發(fā)生凋亡、周期阻滯及誘導(dǎo)細(xì)胞分化,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,這為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用及其他腫瘤的治療提供了潛在的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

且 A1541、A1542、A1543 和洋椿苦素的作用機(jī)制也是不同的，A1541、A1542、A1543 激活 P-ERK，而洋椿苦素則抑制 ERK1/2，但都導(dǎo)致紅白血病細(xì)胞（HEL 和 CB7）發(fā)生紅系和（或）巨核分化、細(xì)胞凋亡、周期阻滯，并且在體內(nèi)都可以延長小鼠的生存時(shí)間。所以無論是 ERK1/2 的激動劑還是拮抗劑均可作為藥物開發(fā)的新思路，用于治療由 ERK1/2 驅(qū)動的白血病或其他癌癥。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 檸檬苦素類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖所示，該類化合物是在中國藥用植物苦楝中提取的，其純度達(dá) 98%以上。

15圖 2-3 化合物 A1541、A1542、A1543 和 Cedrelone 的不同濃度對 HEL 和 CB7 細(xì)胞的抑制率Fig. 2-3 Inhibition rate of HEL and CB7 cells by different concentrations of A1541、A1542、A1543 and Cedrelone2.3 化合物導(dǎo)致紅白血病細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡上述的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了化合物 A1541、A1542、A1543 和 Cedrelone 對白血病細(xì)胞具有較好的殺傷作用，接下來對于化合物以何種方式影響細(xì)胞的生長進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物 A1541、A1542、A1543 的濃度為 0.5 μM 和 Cedrelone 濃度為的5 μM 時(shí)，作用 24 小時(shí)后能夠明顯引起 CB7 細(xì)胞的凋亡，HEL 細(xì)胞輕微的凋亡（見圖 2-4）。HEL 細(xì)胞的凋亡率是從 DMSO 的 1.0%分別增加到加藥后的 2.1%、

圖 2-2 化合物 A1541、A1542、A1543 和 Cedrelone 抑制 HEL 和 CB7 細(xì)胞的生長Fig. 2-2 A1541、A1542、A1543 and Cedrelone inhibit HEL and CB7 cell growth

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本文編號：2830742