目的:利用Transwell共培養(yǎng)板,建立脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)體系,分析檢測茶多酚的抗炎作用,并從AMPK信號通路探討其抗炎作用機制。方法:1處理與分組:建立4個處理組,分別為成熟脂肪細(xì)胞組(N組)、TNF-α處理組(T組)、巨噬-脂肪細(xì)胞共同培養(yǎng)組(R組)和LPS誘導(dǎo)過的巨噬細(xì)胞-脂肪細(xì)胞共同培養(yǎng)組(L組)。成熟脂肪細(xì)胞組是將前體脂肪細(xì)胞加入0.5 mmol/L IBMX、1μmol/L DEX和10μg/mL Inslulin等誘導(dǎo)劑誘導(dǎo),48 h后,添加只含有10μg/mL Inslulin的胎牛培養(yǎng)基誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞成熟分化,脂肪細(xì)胞分化成熟后,即可分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚;TNF-α處理組,是在成熟脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)上,每孔添加10 ng/mL的TNF-α24h后分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚;巨噬-脂肪細(xì)胞共同培養(yǎng)組,是將分化成熟的脂肪細(xì)胞與巨噬細(xì)胞在Transwell共同培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)24h后,分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚;LPS誘導(dǎo)過的巨噬細(xì)胞-脂肪細(xì)胞共同培養(yǎng)組,是將分化成熟的脂肪細(xì)胞與經(jīng)LPS脂多糖誘導(dǎo)過的巨噬細(xì)胞在Transwell共同培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)24h后,分別添加0μg/mL、50μg/mL和100μg/mL不同濃度的茶多酚。2各處理分組添加不同濃度茶多酚48h后,每孔加入RNA提取試劑盒中的裂解液1000μl充分裂解后,將裂解后的細(xì)胞收集到事先標(biāo)號的無RNA酶的EP管中,采用熒光定量PCR的方法檢測各處理組中脂肪細(xì)胞的促炎性因子、抗炎性因子及炎性酶的基因表達(dá)水平。3細(xì)胞分化成熟后加入200μl含有2μl蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物的PIPA裂解液,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組脂肪細(xì)胞的AMPK、Sirt1、NF-кB(p65)、Foxo3a、P53(THr172)及C-JUN(S73)相關(guān)信號通路的磷酸化水平。結(jié)果:1與N0組相比,T0組、R0組和L0組的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12及COX-2和iNOS兩種炎性酶的基因表達(dá)量顯著上升(p0.05)。添加不同濃度茶多酚之后,促炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12及COX-2和iNOS兩種炎性酶的基因表達(dá)量顯著下降(p0.05)且隨茶多酚濃度的增加基因表達(dá)量下降更明顯,有明顯的劑量關(guān)系,說明茶多酚可以抑制T組的促炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12及COX-2和iNOS兩種炎性酶的表達(dá),從而抑制炎癥反應(yīng),這種抑制作用隨茶多酚濃度的升高而增強。2 N0組的IL-4和IL-10基因表達(dá)量很高,T0組、R0組和L0組與N0組相比,IL-4和IL-10基因的表達(dá)量降低(p0.05)。添加不同濃度茶多酚之后IL-4和IL-10的基因表達(dá)量顯著上升(p0.05),且隨濃度的增加上升更為明顯。3 T0組、R0組和L0組與N0組相比各靶點磷酸化表達(dá)被明顯抑制;N50、N100與N0組相比,AMPK磷酸化表達(dá)增強,且N100比N50效果明顯;T50、T100與T0組相比,AMPK、Sirt1、NF-κB(p65)、Foxo3a、P53和C-JUN磷酸化表達(dá)被抑制,添加茶多酚之后,AMPK、Sirt1、NF-κB(p65)、Foxo3a、P53和C-JUN磷酸化表達(dá)明顯上升,且T100比T50效果更為明顯;R50、R100與R0組相比,R50、R100組AMPK磷酸化表達(dá)比R0組高,且R100比R50效果更明顯;L50、L100與L0組相比,L50、L100組AMPK磷酸化表達(dá)上調(diào),且L100組比L50組上調(diào)明顯。只有各靶點磷酸化表達(dá)被抑制,組間總蛋白無差異。結(jié)論:茶多酚對炎癥有一定的抵御作用,可以通過AMPK/Sirt1途徑發(fā)揮抗炎作用,通過降低相關(guān)促炎性因子的基因表達(dá)及升高抗炎性因子的基因表達(dá)發(fā)揮作用,且隨茶多酚濃度的增加抗炎作用增強;巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS脂多糖誘導(dǎo)過后,可以更好的刺激脂肪細(xì)胞分泌促炎性因子。
【學(xué)位單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

以巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系研究茶多酚的抗炎作用機制SIRT1 激活后，SIRT1 導(dǎo)致 LKB1 的未乙酰化，促進(jìn)它進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)及其活化，導(dǎo)致 AMPK 的磷酸化和激活[64]。 敲低 SIRT1 導(dǎo)致 AMPK 激活減少，AMPK 激活劑白藜蘆醇因其抑制作用需要 SIRT1 和 LKB1 的存在[65]。AMPK 也可激活正反饋環(huán)中的SIRT1[66]。在熱量限制時 NAD+可能會增加，最可能通過減少糖酵解和增強來自存儲脂肪酸的 B 氧化的氧化磷酸化[67]，將通過 SIRT1 導(dǎo)致 AMPK 激活，從而有助于抗炎作用[68]。 如圖 1 中示出。

3T3-L1 前脂肪細(xì)胞 3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞圖 2 3T3-L1 脂肪細(xì)胞的分化Figure.2 3T3-L1 adipocytes differentiation同濃度 TP 對脂肪細(xì)胞中 IL-1α基因表達(dá)的影響細(xì)胞介素 1（IL-1）是由許多類型的哺乳動物細(xì)胞（包括骨細(xì)胞）產(chǎn)生。 進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，并參與炎癥和傷口愈合。IL-1 主要是由活化的單核-巨噬和分泌的一種細(xì)胞因子，IL-1 由 IL-1α和 IL-1β構(gòu)成，酸性的 IL-1 稱為 ILIL-1 稱為 IL-1β[87]。IL-1α在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。IL-1 可以細(xì)胞、參與抗體產(chǎn)生、促炎癥反應(yīng)和協(xié)同刺激胸腺細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)激素樣作同樣是促炎性因子作為前炎癥中的一級因子，對炎癥的發(fā)生起著重要的作能夠改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞等外核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)，加重炎癥反應(yīng)。TNF-α同時還是與炎癥嚴(yán)重程度有

以巨噬-脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)體系研究茶多酚的抗炎作用機制相比，IL-1α的基因表達(dá)量并無差異性；T50、T100 與 T0 組相比，添加茶多，IL-1α的基因表達(dá)量明顯下降（p<0.05）且 T100 比 T50 基因表達(dá)量下降明顯茶多酚可以抑制T組IL-1α的表達(dá)從而抑制炎癥反應(yīng)且隨濃度的升高而增強；R 與 R0 組相比，R50、R100 組 IL-1α的基因表達(dá)量比 R0 組低（p<0.05），且 R1 R50 組 IL-1α的基因表達(dá)量更低，說明茶多酚可抑制 R 組 IL-1α的表達(dá)且呈現(xiàn)系。L50、L100與L0組相比，L50、L100組IL-1α的基因表達(dá)量比L0組低（p<0.0500 組比 L50 組 IL-1α的基因表達(dá)量更低，說明茶多酚可抑制 L 組 IL-1α的表達(dá)量效關(guān)系。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2830588