[目的]體外研究芹黃素(API)對(duì)活化狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子、炎癥相關(guān)蛋白、抗炎因子以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響。[方法]1.解剖分離新生24hSD大鼠大腦皮質(zhì),經(jīng)胰酶消化及機(jī)械吹打制成單細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)基,14d后,純化小膠質(zhì)細(xì)胞并進(jìn)行CD11b/c免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。2.將純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞用相同濃度的脂多糖(LPS)(100ng/ml)分別處理不同的時(shí)間(1h,2h,4h,6h,8h,10h),ELISA法檢測(cè)經(jīng)LPS處理不同時(shí)間后小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子(IL-1、TNF-α)的變化,確定炎癥因子分泌最多的時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.將純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度(濃度梯度:5uM/L、20 uM/L、40uM/L、60 uM/L)的芹黃素處理48h,MTT法比較各濃度之間小膠質(zhì)細(xì)胞活性。選取對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活性影響最小的濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.將純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為以下6組:空白對(duì)照組(PBS處理)、脂多糖組(LPS組)、脂多糖+芹黃素5uM組(LPS+API 5uM組)、脂多糖+芹黃素20uM 組(LPS+ API 20uM 組)、脂多糖+芹黃素 40uM 組(LPS+ API 40uM 組)、脂多糖+芹黃素60uM組(LPS+API 60uM組)。5.采用ELISA法分別檢測(cè)以上6組炎癥因子(IL-1、TNF-α)、抗炎因子(IL-10)以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF、PDNF、GDNF)的表達(dá)情況。6.采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western Blot分別檢測(cè)以上6組小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)情況。[結(jié)果]1.對(duì)新生SD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)、純化后,CD11b/c染色陽(yáng)性,所得到的小膠質(zhì)細(xì)胞純度95%。2.小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后,炎癥相關(guān)因子IL-1表達(dá)上調(diào),并于6h時(shí)達(dá)到高峰。3.MTT法檢測(cè)結(jié)果:小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)一定濃度范圍內(nèi)(5-60uM/L)的芹黃素處理后,其活性并未發(fā)生明顯改變。4.ELISA法檢測(cè)結(jié)果:LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子IL-1、TNF-α表達(dá)量明顯增多,而抗炎癥因子IL-10表達(dá)量則明顯減少;而LPS+API各組較LPS組,炎癥因子IL-1、TNF-α表達(dá)量都有明顯下降,抗炎癥因子IL-10表達(dá)量明顯增多,而不同濃度芹黃素水平之間未表現(xiàn)出明顯差異;LPS+API各組營(yíng)養(yǎng)因子GDNF、BDNF、PDNF表達(dá)量均明顯高于單獨(dú)LPS組。5.RT-PCR及Western Blot檢測(cè)結(jié)果:單獨(dú)LPS組炎癥相關(guān)基因iNOS轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平明顯高于其他各組。而LPS+API各組可顯著降低iNOS轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平。[結(jié)論]芹黃素可以抑制活化狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的分泌及炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá),同時(shí)可促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放。為進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了 一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體ＣＤｌｌｂ／ｃ，免疫化學(xué)染色鑒定結(jié)果呈陽(yáng)性，純逡逑化后小膠質(zhì)細(xì)胞純度＞９５％。熒光顯微鏡下觀察，紅色為ＣＤｌｌｂ／ｃ染色，藍(lán)色為逡逑ＤＡＰＩ核染色。（圖１，邋２）逡逑露．：：逡逑圖１分離純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，呈分枝狀或梭狀。Ｂａｒ＝１０（Ｖｍ逡逑ＣＤｌｌｂ／ｃ邐ＤＡＰＩ邐Ｍｅｒｇｅｄ逡逑■ＨＵ逡逑圖２邋ＳＤ大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化后使用ＣＤｌｌｂ／ｃ染色陽(yáng)性。Ｂａｒ＝１０0ｎｍ逡逑２邐ＬＰＳ上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥相關(guān)因子１Ｌ－１和ＴＮＦ－ａ表達(dá)水平逡逑純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)ＬＰＳ邋（ｌｍｇ／Ｌ）處理不同時(shí)間（ｌｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、逡逑８ｈ、ｌＯｈ）后，其分yU的炎癥因子ＩＬ－１和ＴＮＦ－ａ均上調(diào)，在６ｈ時(shí)達(dá)到高峰（木／３逡逑＜０．０５，料產(chǎn)＜０＿０１，＊＊＊尸＜０．００１，圖３，４）逡逑１８逡逑

純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)ＬＰＳ邋（ｌｍｇ／Ｌ）處理不同時(shí)間（ｌｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、逡逑８ｈ、ｌＯｈ）后，其分yU的炎癥因子ＩＬ－１和ＴＮＦ－ａ均上調(diào)，在６ｈ時(shí)達(dá)到高峰（木／３逡逑＜０．０５，料產(chǎn)＜０＿０１，＊＊＊尸＜０．００１，圖３，４）逡逑１８逡逑

最終形成不同片黃素濃度梯度（５ｕＭ、２０ｕＭ、４０ｕＭ、６０ｕＭ）的混合逡逑液。ＭＴＴ實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在此濃度范圍內(nèi)濃度芹黃素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性并無(wú)逡逑明顯影響。（圖５）逡逑１５０ｒ逡逑『■■■Ｉ逡逑r．\lw冢懾澹咤義

本文編號(hào)：2824812