第一部分蓮房原花青素對(duì)阿爾茲海默疾病細(xì)胞模型的保護(hù)作用目的:探索蓮房原花青素對(duì)阿爾茲海默疾病的保護(hù)作用。本研究以β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β,Aβ)干預(yù)大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(Pheochromocytomacells 12,PC12)構(gòu)建阿爾茲海默疾病(Alzheimer's disease,AD)細(xì)胞模型,再通過(guò)蓮房原花青素(Procyanidins from the lotus seedpod,LSPC)干預(yù)AD細(xì)胞模型探索LSPC對(duì)于AD細(xì)胞模型的保護(hù)作用。方法:(1)Aβ干預(yù)時(shí)間以及劑量的確定將PC12細(xì)胞接種于96孔板,將0、5、10、20及40μM不同濃度Aβ25-35,按照6、12、24、48、72h不同干預(yù)時(shí)間分別干預(yù)細(xì)胞,將0μMAβ25-35組設(shè)置為對(duì)照組。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)求得細(xì)胞存活率,根據(jù)細(xì)胞存活率選擇最合適的Aβ干預(yù)時(shí)間以及劑量。(2)LSPC干預(yù)劑量的確定確定Aβ干預(yù)時(shí)間以及劑量后,再通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)確定LSPC干預(yù)劑量。將PC12細(xì)胞接種于96孔板,將1、2.5、5、10、20及40μg/mL不同濃度的LSPC加入細(xì)胞中,預(yù)處理30min后加入Aβ25-35,并設(shè)置空白對(duì)照組和Aβ組。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)求得細(xì)胞存活率,根據(jù)細(xì)胞存活率確定LSPC干預(yù)劑量。(3)蓮房原花青素對(duì)AD細(xì)胞模型的保護(hù)作用將PC12細(xì)胞分為3組:對(duì)照組、Aβ組(20μMAβ干預(yù)PC12細(xì)胞24h)以及LSPC干預(yù)組(10μg/mL LSPC預(yù)處理PC12細(xì)胞30 min后用20μM Aβ干預(yù)PC12細(xì)胞24h)。干預(yù)完成后,通過(guò)倒置顯微鏡觀察和Hoechst染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;然后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,以觀察LSPC對(duì)AD細(xì)胞模型的保護(hù)作用。結(jié)果:(1)根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在5μM Aβ25-35對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響,10μMAβ25-35作用下干預(yù)時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞存活率越低;20μMAβ25-35作用24h后,細(xì)胞存活率出現(xiàn)明顯下降(P0.05),之后細(xì)胞存活率不隨干預(yù)時(shí)間增加而下降;而40μM Aβ25-35干預(yù)12 h后細(xì)胞存活率一直低于50%。因此選用20μM作為Aβ暴露劑量,24 h作為Aβ干預(yù)時(shí)間。(2)由20μM Aβ干預(yù)引起的細(xì)胞凋亡在LSPC劑量由低到10μg/mL.的過(guò)程中逐漸降低,當(dāng)LSPC到達(dá)10μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率顯著增加(0.05),且PC12細(xì)胞存活率此后不再隨LSPC劑量增加而明顯增加。結(jié)果表明10μg/mLLSPC對(duì)AD細(xì)胞模型保護(hù)效果明顯,因此選擇10μg/mL作為L(zhǎng)SPC的干預(yù)劑量。(3)倒置顯微鏡下Aβ組細(xì)胞數(shù)目明顯減少,細(xì)胞形態(tài)變化明顯,而對(duì)照組和LSPC組結(jié)果相似。Hoechst染色顯示Aβ組可見大量凋亡細(xì)胞和核固縮現(xiàn)象,而LSPC組處理后凋亡細(xì)胞數(shù)量減少,核固縮現(xiàn)象亦減少。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示對(duì)照組總凋亡率(Q2+Q3)5%,Aβ組細(xì)胞總凋亡率達(dá)到33.36%(P0.05),而LSPC組比Aβ組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P0.05)。結(jié)論:LSPC可改善AD細(xì)胞模型中的細(xì)胞形態(tài)改變及細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,說(shuō)明LSPC對(duì)于AD具有保護(hù)作用。第二部分蓮房原花青素在動(dòng)物體內(nèi)的代謝分布目的:通過(guò)LC-MS/MS探索LSPC在動(dòng)物體內(nèi)的代謝及分布,以發(fā)現(xiàn)LSPC中對(duì)AD起到保護(hù)作用的有效成分。方法:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)將SPF級(jí)3月齡的SD大鼠一共14只,分為2組,每組7只,喂養(yǎng)2周。對(duì)照組每天根據(jù)大鼠體重灌胃1mL/kg生理鹽水,蓮房原花青素干預(yù)組每天根據(jù)體重200 mg/kg灌胃20 mg/mL的LSPC溶液。第14 d大鼠斷頭后,分離并保留各組織和血漿。LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)前,稱取60 mg凍存組織樣本溶于勻漿器中,充分勻漿并放置-80℃保存,至測(cè)試時(shí)取出。(2)實(shí)驗(yàn)樣本準(zhǔn)備將標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度梯度為0.5、1、2、5、10、20、40、50、80、100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣本取出50μL加入50μLβ-葡萄糖醛酸酶溶液(1500U/mL),pH調(diào)節(jié)至5,震蕩30 s,37℃水浴2 h。向樣本加入20μL內(nèi)標(biāo)溶液,再加入300μL乙酸乙酯溶液,震蕩離心后,取出上清液放入另一 EP管中,再向剩余溶液中加入300μL乙酸乙酯溶液,并重復(fù)以上步驟。上清液放置在35℃空干燥,加入50μL復(fù)溶液,并在室溫下靜置后離心。將EP管中45μL上清溶液取出放入測(cè)試瓶中以備測(cè)定。(3)LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)條件我們使用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀(LC-MS/MS,AB Sciex Q-Traβ 4500,Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)進(jìn)行樣品分析。流動(dòng)相由水相(A)0.2%(v/v)乙酸/水,以及有機(jī)相(B)0.2%(v/v)乙酸/甲醇組成,進(jìn)樣量為5μL。質(zhì)譜離子源采用電離子噴霧(electrospray ionization,ESI)源,采用負(fù)離子檢測(cè)模式,并通過(guò)LC-MS/MS對(duì)各物質(zhì)母離子子離子對(duì)、碰撞能等進(jìn)行了篩選。然后使用質(zhì)譜多反應(yīng)檢測(cè)(Multiple reaction monitoring,MRM)模式對(duì)各種物質(zhì)進(jìn)行掃描和定性,并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。結(jié)果:(1)在腦組織中對(duì)比于對(duì)照組動(dòng)物,LSPC組動(dòng)物海馬中槲皮素(P0.01)、表兒茶素(P0.001)、香草酸(P0.05)、對(duì)羥基苯丙酸(P0.05)、沒(méi)食子酸(P0.01)、3-羥基苯乙酸(3-Hydroxyphenylacetic acid,3-HPAA)(P0.05)均有顯著增加。而槲皮素(P0.01)、表兒茶素(P0.001)、香草酸(P0.05)、對(duì)羥基苯丙酸(P0.05)、阿魏酸(P0.05)、咖啡酸(P0.01)、間香豆酸(P0.001)、3,4-二羥基苯甲酸(P0.001)在LSPC組皮質(zhì)中顯著增加。對(duì)比對(duì)照組與LSPC組動(dòng)物小腦后,發(fā)現(xiàn)槲皮素(P0.01)、沒(méi)食子酸(P0.05)、對(duì)羥基苯丙酸(P0.001)、間香豆酸(P0.05)、3-羥基苯乙酸(P0.01)、間羥基苯甲酸(3-Hydroxybenzonic acid,3-HBA)(P0.05)在 LSPC 組中增加明顯。(2)LSPC組動(dòng)物肝臟和心臟組織中,槲皮素、表兒茶素、咖啡酸和3-羥基苯乙酸均有顯著增加(P0.05);兒茶素在心臟組織中增加;肝臟組織中3-羥基-4-甲氧基苯乙酸(Homovanillicacid,HVA)、沒(méi)食子酸、間羥基苯甲酸增加顯著(P0.05)。在腎臟組織中槲皮素(P0.001),兒茶素(P0.01),表兒茶素(P0.001),HVA(P0.001),咖啡酸(P0.01),香草酸(P0.05),3,4-二羥基苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylaceticacid,3,4-DHPA)(P0.01),3-HBA(P0.001)和鄰苯二酚(0.01)顯著增加。LSPC組動(dòng)物胰腺中槲皮素(0.001),阿魏酸(P0.05),沒(méi)食子酸(P0.05)和間香豆酸(P0.01)增加顯著。槲皮素(P0.05)和3,4-DHPA(P0.01)在LSPC組脾臟中檢出顯著增加。而在腸道內(nèi)容物中,除阿魏酸外,各物質(zhì)均有增加。(3)對(duì)比對(duì)照組,LSPC組動(dòng)物血漿中槲皮素(P0.05)、表兒茶素(P0.05)、丁香酸(P0.001)、阿魏酸(P0.01)、HVA(P0.001)、咖啡酸(0.01)、香草酸(P0.001)、p-HPPA(P0.001)、間香豆酸(P0.05)、PCC(P0.01)、3-HBA(P0.001)、鄰苯二酚(P0.01)均顯著增加。結(jié)論:LSPC干預(yù)后多種成分在動(dòng)物體內(nèi)增加,且不同組織和血漿中的物質(zhì)含量和形式各不相同。而LSPC干預(yù)后槲皮素在體內(nèi)各個(gè)組織中的增加是由于LSPC中槲皮素葡萄糖酸苷(Quercetin-3-O-glucuronide,Q3G)所致。結(jié)合本研究結(jié)果及已有關(guān)于Q3G生物作用的研究報(bào)道,因此推測(cè)Q3G可能是LSPC對(duì)AD起保護(hù)作用的有效成分。第三部分蓮房原花青素對(duì)阿爾茲海默疾病的改善作用及相關(guān)機(jī)制研究目的:本研究第三部分研究主要是通過(guò)AD動(dòng)物模型驗(yàn)證LSPC中Q3G是否具有改善AD動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶能力,并探索Q3G作用的主要通路。方法:(1)將36只C57小鼠分為三組,分別為對(duì)照組、AD組及干預(yù)組,每組各12只。三組通過(guò)側(cè)腦室立體定位分別注射生理鹽水、老化Aβ1-42以及老化Aβ1-42。術(shù)后對(duì)照組和AD組小鼠每天按照20μg/mL體重給予雙蒸水,而干預(yù)組小鼠每天按照50 mg/kg體重給予用雙蒸水溶解的Q3G懸濁液,灌胃30 d,并記錄小鼠體重和進(jìn)食量。(2)小鼠禁食6 h后進(jìn)行腹腔注射糖耐量測(cè)試,并于1周后進(jìn)行腹腔注射胰島素耐量測(cè)試。干預(yù)結(jié)束后,小鼠先進(jìn)行為期各1d的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和十字高架,之后進(jìn)行為期7d的水迷宮實(shí)驗(yàn),測(cè)定小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將小鼠處死并分離保存小鼠海馬及皮層。(3)通過(guò)ELISA分別測(cè)定小鼠腦組織Aβ含量以及腹腔注射糖耐量實(shí)驗(yàn)收集血漿中胰島素含量。通過(guò)HE染色鑒別小鼠腦組織內(nèi)細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡的情況。通過(guò)免疫印跡的方法來(lái)檢測(cè)小鼠腦組織內(nèi)各蛋白含量及磷酸化情況,并結(jié)合免疫組化對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行定位、定性及定量研究。結(jié)果:(1)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AD組小鼠比對(duì)照組學(xué)習(xí)和記憶能力顯著降低(P0.05),而干預(yù)組小鼠明顯改善小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力(P0.05)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及十字高架實(shí)驗(yàn)證明Aβ及干預(yù)Q3G并未導(dǎo)致小鼠自發(fā)活動(dòng)和焦慮樣情緒的改變。(2)腹腔注射糖耐量測(cè)試結(jié)果表明AD組小鼠血糖代謝與對(duì)照組組小鼠有顯著差異(P0.05),Q3G可改善Aβ引起的小鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)(P0.05)。但是腹腔注射胰島素耐量測(cè)試中三組在胰島素分泌并無(wú)差異,且腹腔注射胰島素耐量測(cè)試三組間亦無(wú)明顯差異。(3)ELISA以及免疫組化結(jié)果顯示AD組小鼠比對(duì)照組小鼠腦組織內(nèi)Aβ含量明顯增加(P0.05),而Q3G可顯著降低Aβ在腦組織內(nèi)含量(P0.05)。HE染色結(jié)果表明AD組腦組織內(nèi)細(xì)胞壞死和凋亡比對(duì)照組顯著增加,而Q3G可緩解由Aβ引起的細(xì)胞壞死和凋亡。免疫印跡和免疫組化發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,AD組Tau蛋白磷酸化水平顯著升高,PKR及JNK蛋白磷酸化顯著增多,IRS-1絲氨酸化增加,Akt和ERK磷酸化降低,且GSK蛋白磷酸化水平下降。而Q3G可改善由Aβ導(dǎo)致的小鼠腦組織內(nèi)胰島素抵抗,通過(guò)降低PKR及JNK蛋白磷酸化水平,減少IRS-1絲氨酸化,提升Akt和ERK磷酸化水平,從而增加GSK蛋白磷酸化水平,降低Tau磷酸化水平。結(jié)論:LSPC中Q3G可通過(guò)改善AD模型小鼠胰島素抵抗,調(diào)節(jié)IRS-1絲氨酸化,從而提高小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力,因此Q3G可能是LSPC中改善阿爾茲海默疾病的有效成分。本研究為預(yù)防與治療提供新的思路和方案。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5

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