目的二仙湯由淫羊藿、仙茅、巴戟天、黃柏、當(dāng)歸、知母6味藥材等比例合煎而得,目前廣泛用于治療骨質(zhì)疏松癥,本次實驗研究二仙湯對衰老性骨質(zhì)疏松骨微結(jié)構(gòu)及行為的影響,明確其對氧化損傷成骨細(xì)胞的保護(hù)作用,以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析二仙湯抗衰老性骨質(zhì)疏松作用機(jī)制。方法以D-半乳糖(D-Gal)注射制備衰老性骨質(zhì)疏松模型,觀察二仙湯對衰老性骨質(zhì)疏松大鼠血清生化指標(biāo)的影響;通過Micro-CT檢測骨密度和骨組織形態(tài)變化;使用Morris水迷宮測試方法進(jìn)行定位航行及空間探索實驗,分析每組大鼠間各項游泳數(shù)據(jù)的差異性;采用新生24h Wistar大鼠顱蓋骨分離得到原代成骨細(xì)胞,觀察二仙湯提取物及其有效成分對氧化損傷的成骨細(xì)胞的增殖(MTT)、活性氧簇(ROS)及凋亡的影響;并采用Western blot方法,觀察二仙湯有效成分對氧化損傷的成骨細(xì)胞骨形成蛋白Runx2的影響;使用Cytoscape軟件及靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫預(yù)測二仙湯抗衰老性骨質(zhì)疏松靶點(diǎn),富集主要KEGG通路,以Western blot方法驗證二仙湯對p-Akt、p-mTOR、Beclin1等關(guān)鍵靶點(diǎn)的調(diào)控作用。結(jié)果與空白組相比,模型組血清GSH-Px水平降低、MDA水平升高、ALP水平降低、DPD和IL6水平上調(diào),骨密度明顯降低,骨量丟失嚴(yán)重,定位航行潛伏期時間延長,空間探索能力降低;與模型組相比,給藥組血清GSH-Px水平升高、MDA水平降低、ALP水平升高、DPD和IL6水平均降低,骨吸收速率降低,股骨骨密度增加,骨微結(jié)構(gòu)得到顯著改善,定位航行潛伏期時間縮短,空間探索能力顯著提高;二仙湯水提物、醇提物及有效成分(阿魏酸、仙茅苷、淫羊藿苷、知母皂苷BⅡ、水晶蘭苷、小檗堿)對氧化損傷成骨細(xì)胞模型的增殖活性有顯著保護(hù)作用,同時降低氧化損傷成骨細(xì)胞ROS水平,提高細(xì)胞抗凋亡和抗氧化能力。且二仙湯有效成分(阿魏酸、仙茅苷、淫羊藿苷、知母皂苷BⅡ、水晶蘭苷、小檗堿)具有提高氧化損傷成骨細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)量的作用;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示二仙湯抗衰老性骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)所涉及的生物過程與氧化應(yīng)激通路相關(guān),驗證結(jié)果提示二仙湯藥效成分可降低成骨細(xì)胞p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá),同時提高Beclin1的蛋白表達(dá)量,提示二仙湯可能通過抑制Akt/mTOR信號通路,使Akt和mTOR磷酸化水平減少,提高細(xì)胞自噬作用,抑制成骨細(xì)胞的氧化損傷。結(jié)論(1)二仙湯能夠有效抑制衰老性骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平,提高骨密度,并增強(qiáng)衰老性大鼠的運(yùn)動及學(xué)習(xí)能力。(2)二仙湯及其有效成分對氧化損傷成骨細(xì)胞的增殖作用、ROS水平、抗凋亡能力及Runx2的蛋白表達(dá)量均有顯著改善作用。(3)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果及實驗驗證表明,二仙湯抗衰老性骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制可能與調(diào)控Akt/mTOR信號通路,促進(jìn)細(xì)胞自噬反應(yīng),提高成骨細(xì)胞的抗氧化和抗凋亡能力有關(guān)。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

12內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文（2019）應(yīng)骨吸收狀態(tài)[24]；而 IL-6 為前炎癥細(xì)胞因子，是反映骨丟失的一個重要信號，具有促進(jìn)破骨細(xì)胞活性及抑制破骨細(xì)胞凋亡的作用[25]。Micro-CT 可在微米級水平掃描高清的骨小梁結(jié)構(gòu)，并精確計量標(biāo)本骨參數(shù)，通過 Micro-CT 分析獲得的骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)可以觀測股骨骨密度變化，為骨組織提供了更為精準(zhǔn)的全新測試方法[26-27]。二仙湯對衰老性骨質(zhì)疏松大鼠 GSH-Px、MDA 活性的影響：如圖 1-1-1 所示，與空白組相比，模型組大鼠血清中 GSH-Px 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高；而給藥組 Ale、EXD3、EXD6、EXD12 大鼠均能顯著升高衰老性骨質(zhì)疏松大鼠血清中 GSH-Px 水平、降低衰老性骨質(zhì)疏松大鼠血清中的 MDA 水平。

仙湯對衰老性骨質(zhì)疏松癥大鼠血清中 ALP、DPD 及 IL6 的影（*P<0.05，**P<0.01 VS.CON，#P<0.05，##P<0.01VS.D-Gal衰老性骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織形態(tài)和骨計量參數(shù)模型組大鼠 ROI 區(qū)域較空白組明顯空洞，骨小梁面積le、EXD3、EXD6、EXD12 可顯著改善骨小梁的骨微骨質(zhì)流失。

##P<0.01VS.D-Gal）二仙湯對衰老性骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織形態(tài)和骨計量參數(shù)的影響：如圖1-1-3 所示，模型組大鼠 ROI 區(qū)域較空白組明顯空洞，骨小梁面積及數(shù)量顯著減少；給藥組 Ale、EXD3、EXD6、EXD12 可顯著改善骨小梁的骨微結(jié)構(gòu)，防止大鼠衰老導(dǎo)致的骨質(zhì)流失。

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本文編號：2819218