[背景]肝纖維化是各種慢性肝病過度到肝硬化甚至肝癌的必經(jīng)之路,因此盡早進行診斷治療對于防止疾病惡化、提高患者生存率以及改善患者生活質(zhì)量具有重要意義。目前大量的文獻證實肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。當(dāng)肝臟受到損傷因子刺激時,靜息的HSC會激活轉(zhuǎn)變成活化型HSC,自身不斷增殖分泌大量ECM,此外還持續(xù)釋放多種趨化因子損傷周邊的肝細胞、枯否細胞等,進一步加劇肝臟病理狀態(tài),所以靶向抑制HSC活化已經(jīng)成為改善以及治療肝纖維化的關(guān)鍵策略。發(fā)掘靶向抑制HSC活化進而緩解肝纖維化進程的安全高效的藥物目前是抗肝纖維化治療領(lǐng)域的研究熱點。本課題致力于抗肝纖維化天然產(chǎn)物藥物的研究,發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物具有良好的改善肝纖維化的療效。而嵩甲醚(Artemether,ART)作為臨床一線抗瘧藥物,開發(fā)其抗肝纖維化這一新的藥理活性,將為其相關(guān)臨床疾病的治療帶來曙光。本研究旨在明確蒿甲醚對肝纖維化的改善作用,并闡明其作用機制。本研究實驗結(jié)果將為ART作為抗肝纖維化藥物提供數(shù)據(jù)支撐,為ART的作用機制以及潛在靶點提供了嶄新的思路和方向。[方法]1.臨床樣本檢測從南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院獲取28例臨床肝臟活檢、肝硬化以及肝癌患者肝臟樣本,免疫熒光、馬松染色以及Real-time PCR考察BRD7分子與肝臟疾病進程的關(guān)系。2.體內(nèi)實驗80只雄性ICR小鼠隨機分成10組(每組8只):正常對照組、CC14造模組、CC14+空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組、ART低劑量組(5 mg/kg)、ART中劑量組(10 mg/kg)、ART高劑量組(20 mg/kg)、ART(10 mg/kg)+ 空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組、BRD7 shRNA組、ART(10 mg/kg)+BRD7 shRNA組、秋水仙堿組。肝臟宏觀檢查、蘇木精-伊紅染色、馬松染色、天狼星紅染色直觀考察小鼠肝臟結(jié)構(gòu)變化,谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及堿性磷酸酶試劑盒檢測評估小鼠肝損傷情況,羥脯氨酸以及肝纖四項(透明質(zhì)酸、層黏連蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原)試劑盒檢測評估小鼠纖維化程度,Real-time PCR、western blot、免疫組化以及免疫熒光考察小鼠肝臟HSC活化(a-SMA、Fibronectin、Collagen 1)和促纖維化(PDGF-βR、EFGR)指標(biāo)的水平;此外,免疫熒光以及普魯士藍染色觀察小鼠肝臟鐵死亡的發(fā)生。3.體外實驗選取人源性肝星狀細胞LX2、正常肝細胞LO2、肝癌細胞HepG2以及SMMC7721作為體外研究對象,MTT和臺盼藍染色考察HSC細胞活力以及死亡情況;免疫熒光、western blot、Real-time實驗考察HSC活化指標(biāo)的表達;臺盼藍染色、PGSK染色、電鏡觀察、試劑盒檢測評估HSC鐵死亡的發(fā)生;Western blot、免疫共沉淀、免疫熒光檢測BRD7的蛋白表達以及P53、BRD7分子的結(jié)合情況。[結(jié)果]臨床肝臟樣本的馬松、免疫熒光染色以及Real-time PCR結(jié)果顯示與正常肝組織相比,隨著肝臟病程加重,BRD7的表達與a-SMA的表達呈現(xiàn)負相關(guān)。體內(nèi)研究結(jié)果顯示,ART可以顯著改善CC14所致的肝臟病理改變、膠原沉積、HSC細胞的活化以及促纖維化因子的表達。機制研究發(fā)現(xiàn),ART可以選擇性地促進活化型HSC細胞表達鐵死亡關(guān)鍵指標(biāo)(SLC2A11、Ptgs2、鐵離子)并促使其發(fā)生鐵死亡,這提示ART對肝纖維化的改善作用與其介導(dǎo)HSC細胞鐵死亡密切相關(guān)。深入機制探討發(fā)現(xiàn)ART可以增強肝臟BRD7的表達,而BRD7 shRNA可以削弱ART促進HSC鐵死亡以及抗肝纖維化作用,這表明BRD7分子極有可能是ART發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子。體外實驗結(jié)果顯示,ART可以劑量依賴性地降低HSC活化指標(biāo)蛋白以及基因水平的表達。同時,ART可以誘導(dǎo)HSC呈現(xiàn)出鐵死亡的表型:鐵離子聚集、脂質(zhì)過氧化物過載、抗氧化系統(tǒng)失調(diào)以及線粒體皺縮,使用鐵死亡抑制劑Fer-1反向驗證證明ART的確通過介導(dǎo)鐵死亡抑制HSC活化。深入機制探討發(fā)現(xiàn)ART可以明顯提高BRD7的表達,介導(dǎo)BRD7與P53綁定入核并調(diào)控下游鐵死亡關(guān)鍵因子SLC 7A11的轉(zhuǎn)錄表達,進而調(diào)節(jié)鐵死亡進程。而這一作用則能被BRD7干擾顯著削弱,結(jié)果表明BRD7-P53-SLC7A11通路介導(dǎo)的鐵死亡是ART抗肝纖維化的基礎(chǔ)。[結(jié)論]本研究體內(nèi)外實驗首先證明ART確實具有抗肝纖維化的療效,而且這一作用與ART誘導(dǎo)活化型HSC發(fā)生鐵死亡密切相關(guān)。此外,通過軟件數(shù)據(jù)分析以及臨床樣本、小鼠纖維化肝臟樣本和細胞實驗觀察發(fā)現(xiàn)BRD7極有可能與纖維化進程呈現(xiàn)負相關(guān)。進一步體內(nèi)外實驗驗證ART可以促進BRD7的高表達,而且ART誘導(dǎo)的鐵死亡依賴于BRD7介導(dǎo)的P53入核。本實驗為ART作為抗肝纖維化藥物提供數(shù)據(jù)支撐,而且為靶向BRD7分子抗纖維化治療提供研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖１－３邋Ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ主要調(diào)控通路逡逑Ｆｉｇ．１－３邋Ｍａｊｏｒ邋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｏｆ?

－４邋Ｔｈｅ邋ｓｏｕｒｃｅ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｆｏｒｍｕｌａ邋ｏｆ邋ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ邋（Ｗｕ邋Ｊ，Ｌｉ邋Ｈ，Ｌｉ邋Ｍ．邋Ｅｆｆｅｃｔｅｔｈｅｒ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，邋ａｖｏｖｔｏｓｉｓ，邋ａｎｄ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：邋ｐｏｔｅｎｃａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｐｓｏｒｉａｓｉｓ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．邋Ｉｎｔ邋Ｊ邋Ｃｌｉｎ邋Ｅｘｖ邋Ｍｅｄ．邋２０１５；邋８（５）：７０６９－７０７８）［４７］逡逑本課題科學(xué)問題的提出與內(nèi)容逡逑我們在前期進行預(yù)實驗，免疫熒光以及ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實驗結(jié)果揭示蒿甲明顯降低活化型ＨＳＣ中ａ－ＳＭＡ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ以及Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋１的表達，顯示蒿甲醚確實具有抗肝纖維化的潛能。更有趣的是，青蒿素類藥物過氧橋這一特殊結(jié)構(gòu)，被公認為是鐵死亡的誘導(dǎo)劑［５２－５３］。但是蒿甲醚調(diào)控ＨＳＣ鐵死亡發(fā)揮抗肝纖維化作用以及具體分子機制的探討目前未見報道。逡逑為此，本論文采用動物疾病模型以及細胞實驗的手段，首先采用體內(nèi)證蒿甲醚對經(jīng)典ＣＣ１４致肝纖維化模型具有明顯緩解作用以及對活細胞具有顯著抑制作用；接著證實蒿甲醚抗肝纖維化的作用確實與

邐第二章蒿甲醚體內(nèi)外顯著緩解肝纖維化狀況周（Ｆｌｇ．邋２－１）。空白對照組：接受橄欖油腹腔注射；模型組：接受１０％邋ＣＣ１４腹逡逑腔注射８周（每只小鼠０．５ｍｌ／１００ｇ），每周三次【１５］；蒿甲醚低、中、高劑量給藥逡逑治療組：除了接受１０％邋ＣＣ１４腹腔注射８周外，在第５－８周期間同時每天接受低逡逑（５ｍｇ／ｋｇ）、中（１０ｍｇ／ｋｇ）、高（２０ｍｇ／ｋｇ）齊ｌｊ量的蒿甲醚腹腔注射；陽性藥秋水逡逑仙堿（０．１邋ｍｇ／ｋｇ）治療組：除了接受１０％邋ＣＣＵｆ腔注射８周外，在第５－８周期逡逑間同時每天接受秋水仙堿腹腔注射。在末次給藥處理后，對所有小鼠進行１天逡逑的禁食不禁水的操作。實驗結(jié)束后，每只小鼠稱重并進行眼眶取血，采血完畢逡逑后剝離完整肝臟以及記錄肝臟重量，用于計算肝指數(shù)（％）。獲取的小鼠血液室逡逑溫靜置過夜后，離心（２０００邋ｒ／ｍｉｎ，邋２０邋ｍｉｎ）所得的上層血清，－２０°Ｃ凍存，用于逡逑后續(xù)血清學(xué)指標(biāo)的檢測；分離的肝臟樣本，分成若干部分，部分在１０％福爾馬逡逑林中性緩沖液固定于室溫保存用于后續(xù)切片染色實驗，部分在－８０°Ｃ或液氮中逡逑快速冷凍保存用于后續(xù)的試劑盒、ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ以及ＰＣＲ檢測。逡逑

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10 張揚;劉瓊璋;張端科;江燕斌;;β-蒿甲醚的多晶型、晶體結(jié)構(gòu)解析與晶習(xí)研究[J];化工學(xué)報;2011年10期

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7 肖樹華;鄭江;梅靜艷;焦佩英;王存志;宋宇;黃安生;楊忠;徐明生;田子英;;蒿甲醚預(yù)防日本、曼氏和埃及血吸蟲病的應(yīng)用及基礎(chǔ)研究[A];預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)科發(fā)展藍皮書——2002卷[C];2002年

8 白克華;邢杰;王銳利;張淑秋;;蒿甲醚在大鼠體內(nèi)多劑量藥動學(xué)的時間依賴性[A];第九屆全國藥物和化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

9 王潤田;崔o

本文編號：2817040